分子對接與藥物虛擬篩選

分子對接的最初思想起源于FisherE提出的“鎖和鑰匙模型”。即受體與配體的相互識別首要條件是空間結構的匹配

配體受體復合物受體－配體的鎖和鑰匙模型

Ohboy!Whataperfectmatch

這類方法首先要建立大量化合物（例如幾十至上百萬個化合物）的三維結構數據庫，然后將庫中的分子逐一與靶標分子進行“對接”（docking），通過不斷優化小分子化合物的位置（取向）以及分子內部柔性鍵的二面角（構象），尋找小分子化合物與靶標大分子作用的最佳構象，計算其相互作用及結合能。在庫中所有分子均完成了對接計算之后，即可從中找出與靶標分子結合的最佳分子（前50名或前100名）

分子對接的基本原理藥物與受體的結合強度取決于結合的自由能變化?G結合

=?H結合

-T?S結合

=-RTlnKi大部分的分子對接法忽略了全部的熵效應，而在焓效應也只考慮配體與受體的相互作用能，即：Einteraction=Evdw+Eelectrostatic+Eh-bond§7.4.1分子對接的基本方法（一）剛性的分子對接方法

這種方法是最初的分子對接的方法，在對接中，小分子和蛋白質兩種都保持剛性。（1）基于最大團搜索的方法（Clique-SearchBasedApproaches）

對接兩個剛性分子可以理解為分子在空間的匹配問題，這種匹配可以是一種形狀上的互補或相互作用。如氫鍵受體與氫鍵給體的互補。搜索在三維空間中有效的條件下的最大匹配受體的活性位點

配體有效匹配的距離圖集

受體－配體的示意圖，字母代表特征部分如氫鍵等，相應的有效匹配的圖集如右，三個環性頂點組織的三角形為這個圖集的一個最大團(clique)

Dock對接程序中剛性對接的算法就是基于這種思想Dock利用球集來表示受體活性位點和配體的形狀

一系列的球集填充在受體活性位點的表面，這些球集代表能被配體占據的體積。配體可以用球集表示或者用自己的原子表示，在Dock程序中，四個有效匹配的對應點被考慮，先考慮配體中第一個球集與活性位點的球集的匹配，第二個點則滿足?d≤ε，其中?d為第二個匹配點中配體和受體的球心與第一個點球心的距離，第三個點又必需滿足與前兩個球心的距離限制，以上過程一直進行到找不到更多匹配點為止。（2）基于幾何哈希技術“geometrichashing”的方法第一部分中，幾何哈希表從被對接的一個配體或一系列配體中構建。哈希矩陣含有配體名字和能調整配體在空間方向的參考框架。第二部分即識別階段，蛋白質的特征用來識別哈希矩陣，每一次匹配表示蛋白質的特征與哈希矩陣中已定義好方位的配體相匹配，具有大量匹配信息的哈希矩陣代表著具有幾個吻合特征的配體和方位(3）基于poseclustering的方法

這種方法與幾何哈希的方法相類似，也是一種基于模式識別的方法。

在LUDI模型中，如圖所示，對每一個作用基團，定義作用中心和作用表面。受體的作用表面近似地用離散的點表示，和對應的配體的中心目標點相匹配。三個氫鍵受體的作用表面

Poseclustering算法中的作用點

（二）柔性對接的方法（1）構象的系綜方法

Flexibase用來儲存小分子庫中每個分子的一系列不同構象，用距離幾何和能量最小化的方法產生構象，每個分子根據rmsd的差異選擇25個系列構象。每個構象采用FLOG剛性對接的方法進行對接。（2）片段的方法

片斷的方法是處理小分子柔性的最通用的方法，配體分割成一些小的片斷，這些片斷可以認為是剛性構象或一個小的構象系綜。一般，有兩種方法來處理:第一種方法是把一個片段放入受體的作用位點，然后加上余下的片段，這種方法稱為連續構建“incrementalconstruction”.第二種方法把所有或一部分片段獨立地放入受體的作用位點，再重新連接至到構成一個完整的配體分子，這種策略稱為“放置&加”“place&join”在TGEV的主蛋白酶三維晶體結構的基礎上，構建了SARS病毒的3C－like蛋白酶三維結構二維結構用結構轉換程序如CORINA、CONCORD實現三維結構的轉化。（二）SARS冠狀病毒3C-like蛋白酶抑制劑的設計8中將原始PDB中的配體、水、離子及結合因子等刪除，然后把缺失的殘基和原子補全，分別存成protein.受體－配體的鎖和鑰匙模型AmpC-lactamse盡管化合物結構各異，但所有CDKs的小分子抑制劑有一些共同的特點：（一）配體對CDK2，CDK4激酶選擇性的研究第二步，確定一個一個類似如打分函數的目標函數。通過CDK4－NU6102復合物和CDK2－NU6102復合物結構對比，可以很清楚地看到造成NU6102親和力差別的主要原因是在CDK2－NU6102復合物中，Asp86位起了一個很重要的識別作用，它與配體的磺胺基形成了兩個穩定的氫鍵，并且通過能量分解的方法也可以得到導致配體活性差異主要識別基團在磺胺基(3）基于poseclustering的方法在優化好的3Cl蛋白酶的三維結構模型和DOCK對接程序參數的基礎上，對含有數十萬多個小分子化合物庫（一）配體對CDK2，CDK4激酶選擇性的研究如氫鍵受體與氫鍵給體的互補。>autoMSprotein.

第一個連續構建的算法是Kuntz發展的Dock程序，首先，一個單獨的錨碎片通過手工選擇對接進受體的活性結合位點，并且考慮了氫鍵的作用。其次這個錨的優勢位置主要包含有有大量匹配氫鍵對，高打分值，和低相似性。接著，一種回溯的算法（backtrackingalgorithm）用來搜索整個配體在結合位點的非重疊放置空間，在當前位置加上一個碎片后，優化的方法用來減少立體的張力和改善氫鍵的幾何構型。最后的位置通過過濾，優化和基于力場的方法來打分評價。FlexX也是一個基于連續構建算法的對接程序（3）遺傳算法和進化規劃遺傳算法開始應用到分子對接技術，其特點為：第一步，一個稱為染色體的線性表示符能夠描述構型的所有自由度，找到這個染色體描述符是算法中最困難的一步。第二步，確定一個一個類似如打分函數的目標函數。著名的GOLD軟件包括了這種算法（4）基于分子模擬的方法模擬退火的方法，Autodock程序就采用了這種方法分子動力學的方法

MonteCarlo模擬，一種統計力學的方法，這種算法中最重要的兩部分是自由度的描述和能量的評價，合適的自由度描述可以避免較高能量的構象，用鍵角、扭曲角等內座標來描述配體的柔性比用笛卡兒空間的三維座標描述要強，同樣，能量的評價也是最耗時，這一步時間必須足夠的長。?G結合=?H結合-T?S結合=-RTlnKi（一）配體對CDK2，CDK4激酶選擇性的研究AmpC-lactamse(3）基于poseclustering的方法在LUDI模型中，如圖所示，對每一個作用基團，定義作用中心和作用表面。一系列的球集填充在受體活性位點的表面，這些球集代表能被配體占據的體積。配體可以用球集表示或者用自己的原子表示，在Dock程序中，四個有效匹配的對應點被考慮，先考慮配體中第一個球集與活性位點的球集的匹配，第二個點則滿足?d≤ε，其中?d為第二個匹配點中配體和受體的球心與第一個點球心的距離，第三個點又必需滿足與前兩個球心的距離限制，以上過程一直進行到找不到更多匹配點為止。（3）主要通過和ATP競爭來占據酶的ATP結合口袋；受體－配體的鎖和鑰匙模型第三步，對接和打分，這一步是虛擬篩選的核心步驟。0初篩，從每一個數據庫篩選結果中選擇DOCK打分前1000名的分子，進一步做類藥性分析和多種評價函數包括SYBYL中的Cscore打分函數和Autodock的經驗自由能評價方法進行打分，再根據藥物化學家的經驗來進行人工挑選，最終對每個數據庫選擇100個分子進行生物測試，這次虛擬篩選找到300個可能具有抗SARS冠狀病毒的候選化合物，發現了7個具有高活性的化合物，進一步的細胞水平的實驗，發現5-HT受體拮抗劑具有明顯的抗SARS病毒感染和保護細胞的作用，其EC50值小于10mg/L，這一研究成果已經申請專利pdb，用Sybyl或Weblab等程序觀看球集的分布。第一步，一個稱為染色體的線性表示符能夠描述構型的所有自由度，找到這個染色體描述符是算法中最困難的一步。一系列的球集填充在受體活性位點的表面，這些球集代表能被配體占據的體積。NU6102(6-cyclohexylmethyl-2-(4’-sulfamoylanilino)purine)是第一個基于活化狀態的CDK2-cyclinA復合物結構的高效的小分子抑制劑。評價：打分函數

每一個對接的算術都會采用平衡了時效和精確度的簡單自由能預測方法，現在的打分函數主要包括三種：基于經驗的回歸參數的方法；基于分子力場的方法和基于知識的方法、基于知識的打分函數。（1）基于力場的方法

只考慮熱焓對能量的貢獻，不考慮熵的影響，一般情況下，采用標準力場的非鍵作用能如真空靜電和范德華作用能用作打分函數，如DOCK程序中采用AMBER的能量函數：（2）基于經驗的打分函數

基于經驗的打分函數用多元回歸的方法擬合各種物理參數對結合自由能的貢獻，如FlexX程序中采用下列函數，所采用的方程包括，配體旋轉鍵的個數、氫鍵、離子鍵，疏水和芳香環的

堆積作用，以及親水作用。這種方法能快速直接地估算結合自由能，（3）基于知識的打分函數

最初應用于蛋白質結構預測，打分函數用統計力學的方法得自蛋白質－配體的復合物結構，結合自由能用函數為分子間距離的平均能的加和來計算。基于知識的打分函數是一種比較有前途的方法虛擬篩選的具體流程包括4個步驟：受體模型的建立；小分子庫的產生；計算機篩選和命中化合物的后處理。第一步，受體模型的建立：蛋白質結構的準備是虛擬篩選的重要一步。虛擬篩選的蛋白靶標的結構可以從PDB庫()中直接下載使用也可以通過和家族中同源蛋白的序列、結構信息比較，同源模建而得1）大分子結構獲取2）接著是結合位點的描述，選擇合適的配體結合口袋對分子對接至關重要一種是直接從配體－受體復合物結構中抽出；選擇口袋有兩種方式：如果沒有復合物結構，則需要根據生物功能如結合、突變等實驗信息來手動選擇結合部位第二步，建立小分子數據庫二維結構用結構轉換程序如CORINA、CONCORD實現三維結構的轉化。建好的三維結構加氫加電荷后，便可以用于對接程序。第三步，對接和打分，這一步是虛擬篩選的核心步驟。對接操作就是把每個小分子放到受體蛋白的配體結合位點，優化配體構像和位置，使之與受體有最佳的結合作用，給最佳結合構象打分，對所有化合物根據打分排序，然后從化合物庫中挑出打分最高的小分子。蛋白質結構的準備是虛擬篩選的重要一步。>autoMSprotein.?G結合=?H結合-T?S結合=-RTlnKi（二）SARS冠狀病毒3C-like蛋白酶抑制劑的設計8中將原始PDB中的配體、水、離子及結合因子等刪除，然后把缺失的殘基和原子補全，分別存成protein.Unity/FlexX最初應用于蛋白質結構預測，打分函數用統計力學的方法得自蛋白質－配體的復合物結構，結合自由能用函數為分子間距離的平均能的加和來計算。NU6102(6-cyclohexylmethyl-2-(4’-sulfamoylanilino)purine)是第一個基于活化狀態的CDK2-cyclinA復合物結構的高效的小分子抑制劑。一系列的球集填充在受體活性位點的表面，這些球集代表能被配體占據的體積。（一）配體對CDK2，CDK4激酶選擇性的研究通過序列聯配和采用MOLCAD/SYBYL活性位點分析，表明SARS病毒3C-like蛋白酶和TGEV主蛋白酶兩者的結合口袋比較類似Dehydrogrnase用showsphere程序由protein.二維結構用結構轉換程序如CORINA、CONCORD實現三維結構的轉化。（Clique-SearchBasedApproaches）最后一步是命中化合物的后處理通過計算分子的類藥性質ADME/T(吸收absorption、器官分布distribution、體內代謝metabolism、排泄excretion和毒性toxicity)性質的估算，排除那些不具有類藥性質的分子。可以利用一些經驗規則如“五規則”等，快速排除那些不適合進一步藥物開發的分子。通過以上四步處理，大部分分子從化合物庫中剔除，形成一個合理大小的化合物庫，僅對這些適合成藥的化合物或購買、或合成、或分離得到，然后再進行實際的生物測試。第一種方法是把一個片段放入受體的作用位點，然后加上余下的片段，這種方法稱為連續構建“incrementalconstruction”.(3）基于poseclustering的方法Ohboy!Whataperfectmatch用showsphere程序由protein.第二步，確定一個一個類似如打分函數的目標函數。AmpC-lactamse在TGEV的主蛋白酶三維晶體結構的基礎上，構建了SARS病毒的3C－like蛋白酶三維結構（二）SARS冠狀病毒3C-like蛋白酶抑制劑的設計5DOCK具體操作實例8中將原始PDB中的配體、水、離子及結合因子等刪除，然后把缺失的殘基和原子補全，分別存成protein.Unity/FlexXSARS病毒3C-like蛋白酶和TGEV主蛋白酶與抑制劑結合圖對接兩個剛性分子可以理解為分子在空間的匹配問題，這種匹配可以是一種形狀上的互補或相互作用。第一個連續構建的算法是Kuntz發展的Dock程序，首先，一個單獨的錨碎片通過手工選擇對接進受體的活性結合位點，并且考慮了氫鍵的作用。（3）主要通過和ATP競爭來占據酶的ATP結合口袋；對接方法尚需解決的問題：分子的柔性溶劑化效應打分函數分子對接的應用靶

標靶標分類靶標結構小分子庫大小所用方法抑制劑活性

M實驗數據AmpC

-lactamseHydrolaseX-ray200kNWUDOCK26X-ray復合物BCR－ABLKinaseX-ray200kDOCK25細胞的抑制活性實驗AnthraxEFAdenylylcyclaseX-ray200kNWUDOCK20酶動力學實驗IMPDHDehydrogrnaseX-ray3500kFlexX30酶動力學實驗CaseinkinaseIIKinaseHomology400kDOCK0.08抑制活性、構效關系K＋

通道IonchannelHomology50kDOCK10細胞的抑制活性實驗ThyroidhomonereceptorNuclearreceptorHomology250kICM0．75抑制活性實驗CDK2KinaseX-ray50kLIDAEUS2X-ray復合物TGF

RKKinaseX-ray200kCatalyst0．005X-ray復合物cyclophilinImmunophilinX-rayUnity/FlexX6細胞的抑制活性實驗tRNAguaninetransglycoslaseX-ray800kUnity/FlexX0.25酶動力學實驗PfDHFRReductaseHomology230kCatalyst/DOCK0.9酶動力學實驗

-AmylaseHydrolaseX-ray200kUnity/FlexXNMR,SPR,層析（一）配體對CDK2，CDK4激酶選擇性的研究細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin-dependentkinases,CDKs）是一類Ser/Thr蛋白激酶，直接參與調控細胞分裂周期，顧名思義，CDK只在周期蛋白Cyclin活化下才能工作.現在已經發現了13種CDK蛋白激酶和25種周期蛋白Cyclin，但它們具體的生物功能還不十分明了。其中CDK2、CDK5、CDK6已經解析出晶體結構，但CDKs的一級序列存在高的同源性，它們之間一級序列的高同源性暗示了三維結構的相似性CDK1、CDK2、CDK4、CDK6是基于CDKs結構化學治療癌癥的主要靶標。至今為止，文獻報告的CDKs抑制劑有多種盡管化合物結構各異，但所有CDKs的小分子抑制劑有一些共同的特點：（1）一般小的分子量（<600）;

（2）平面、疏水性的多環化合物；（3）主要通過和ATP競爭來占據酶的ATP結合口袋；（4）主要通過疏水和氫鍵作用和酶結合；（5）配體與CDK2作用時，一般與Leu83和Glu81形成氫鍵。NU6102(6-cyclohexylmethyl-2-(4’-sulfamoylanilino)purine)是第一個基于活化狀態的CDK2-cyclinA復合物結構的高效的小分子抑制劑。實驗表明NU6102對CDK2和CDK4有著不同的選擇活性，對CDK2有一個較高的親和力Ki=6nM，但是對CDK4的親和力比較低Ki=1600nM，為了解釋這種選擇性差異的起源小分子NU6102的結構

CDK2－NU6102的作用模式圖

解決思路：采用同源模建、分子對接、分子動力學模擬和自由能計算來闡明配體和激酶的作用機理。由于CDK4的三維結構還沒有解析出來，所以我們通過序列聯配、同源模建的方法得到CDK4的結構，在通過分子對接的方法得到NU6102－CDK4的復合物結構。CDK2和CDK4的序列聯配，序列同源性45.6%

通過分子對接得到CDK4－NU6102的作用模式

通過CDK4－NU6102復合物和CDK2－NU6102復合物結構對比，可以很清楚地看到造成NU6102親和力差別的主要原因是在CDK2－NU6102復合物中，Asp86位起了一個很重要的識別作用，它與配體的磺胺基形成了兩個穩定的氫鍵，并且通過能量分解的方法也可以得到導致配體活性差異主要識別基團在磺胺基

（二）SARS冠狀病毒3C-like蛋白酶抑制劑的設計熊兵等人結合同源模建、分子虛擬篩選的方法設計了抗SARS冠狀病毒3C-like蛋白酶的抑制劑。SARS冠狀病毒3C－like蛋白酶在SARS病毒其他功能蛋白的形成過程中起重要作用，阻斷SARS病毒3C－like蛋白酶的作用可以阻止SARS病毒的復制，并最終達到治療SARS的目的在TGEV的主蛋白酶三維晶體結構的基礎上，構建了SARS病毒的3C－like蛋白酶三維結構SARS病毒的3C-like蛋白酶的三維模建結構

通過序列聯配和采用MOLCAD/SYBYL活性位點分析，表明SARS病毒3C-like蛋白酶和TGEV主蛋白酶兩者的結合口袋比較類似同一結構家族的組織蛋白酶抑制劑分別與SARS冠狀病毒3C-like蛋白酶和TGEV的主蛋白酶的復合物模型如圖7－23，從圖中可以看出兩者的作用模式也是十分類似。SARS病毒3C-like蛋白酶和TGEV主蛋白酶與抑制劑結合圖

在SARS病毒3C-like蛋白酶活性位點確定之后，再通過查詢MDDR數據庫得到了73個蛋白酶抑制劑的小分子數據，對SARS病毒3C-like蛋白酶和TGEV的主蛋白酶進行了分子對接參數的調節和優化。結果表明大多數分子與兩個蛋白酶的結合相似，并且對DOCK打分進行相關性分析，表明結合能力較為一致，在優化好的3Cl蛋白酶的三維結構模型和DOCK對接程序參數的基礎上，對含有數十萬多個