學必求其心得，業(yè)必貴于專精學必求其心得，業(yè)必貴于專精學必求其心得，業(yè)必貴于專精1．2基因工程的基本操作程序1．簡述基因工程的原理及基本操作程序。2．嘗試設計某一轉基因生物的研制過程。一、目的基因的獲取1．從基因文庫中獲取目的基因將含有某種生物不同______的DNA片段導入________的群體中儲存，各個________分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫。基因文庫包括兩種：________文庫，即包含一種生物所有基因的文庫；________文庫，即只包含一種生物的一部分基因的文庫，如______文庫。2．利用PCR（1）PCR的含義:是一項在生物______復制特定DNA片段的核酸合成技術。（2）目的：短時間內大量擴增目的基因。(3）原理：__________。（4）過程：第一步,加熱至90～95℃，________________。第二步，冷卻至55～60℃，________________________________________________。第三步，加熱至70～75℃，________________________________________________。如此重復循環(huán)多次.（5）特點：指數形式擴增。3．用化學方法人工合成如果基因比較____，核苷酸序列又已知，也可以通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成。二、基因表達載體的構建基因表達載體的組成：必須有啟動子、________、終止子以及________等。1．啟動子啟動子是一段有特殊結構的______片段,位于基因的首端，是____________________的部位,可驅動基因______。2．終止子終止子也是一段______短片段，位于基因尾端,使______在需要的地方停止。3．標記基因標記基因的作用是為了鑒定受體細胞中是否含有________，從而將含有________的細胞篩選出來。三、將目的基因導入受體細胞1．轉化________進入受體細胞內,并且在受體細胞內________和______的過程,稱為轉化。2．常用的導入方法(1）將目的基因導入植物細胞：采用最多的方法是________轉化法，其次還有________法和__________法。（2)將目的基因導入動物細胞:最常用的方法是______技術.此方法的受體細胞多是________。（3）將目的基因導入微生物細胞：______處理法。①用________處理細胞，使細胞處于能吸收周圍環(huán)境中________的生理狀態(tài)，這種細胞稱為________細胞.②將重組表達載體DNA分子與感受態(tài)細胞混合，在一定溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子，完成轉化過程.四、目的基因的檢測與鑒定1．首先要檢測轉基因生物的DNA上是否插入了______，方法是采用__________技術。2．其次還要檢測目的基因是否轉錄出了______,方法是采用________技術。3．最后檢測目的基因是否翻譯成________，從分子水平檢測的方法是采用______________技術。4．有時還需進行__________水平的鑒定.如需要做抗蟲或抗病的接種實驗等.答案：一、1。基因受體菌受體菌基因組部分基因cDNA2．（1）體外（3)DNA雙鏈復制（4）DNA解鏈為單鏈引物與兩條單鏈DNA相應互補序列結合熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶)從引物起始進行互補鏈的合成3．小二、目的基因標記基因1．DNARNA聚合酶識別和結合轉錄2．有特殊結構的DNA轉錄3．目的基因目的基因三、1。目的基因維持穩(wěn)定表達2．（1）農桿菌基因槍花粉管通道（2）顯微注射受精卵(3）Ca2＋Ca2＋DNA分子感受態(tài)四、1。目的基因DNA分子雜交2．mRNA分子雜交3．蛋白質抗原-抗體雜交4．個體生物學1．基因、基因文庫、目的基因的比較(1)基因：基因是有遺傳效應的DNA片段，是控制生物性狀的遺傳物質的結構和功能的基本單位，基因的脫氧核苷酸序列代表遺傳信息.（2）基因文庫：①構建：基因組DNA通過限制性核酸內切酶剪切后,對DNA片段進行密度梯度離心分級分離,分別導入受體菌的群體中儲存。②目的:用以分析和分離特定的基因片段.③類型：基因組文庫、cDNA文庫。（3）目的基因:是指基因工程操作中需要的外源基因，它是編碼某種蛋白質的結構基因，如生物的抗逆性基因、抗蟲基因等。2．基因表達載體的構建不同基因可以拼接的原因：不同生物的基因具有相同的結構和化學組成，都是雙螺旋結構，都由四種脫氧核糖核苷酸組成,都遵循相同的堿基互補配對原則，A-T，G-C。3．目的基因的導入（1）不同受體細胞的常用導入方法生物種類植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農桿菌轉化法顯微注射法Ca2＋處理法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉化過程目的基因插入Ti質粒的TDNA上→導入植物細胞→整合到受體細胞的DNA→表達目的基因表達載體提純→取卵（受精卵）→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→感受態(tài)細胞→表達載體與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子(2）農桿菌導入法分析①完成基因表達載體的構建，需要限制性核酸內切酶和DNA連接酶。②重組的基因表達載體(重組質粒）導入農桿菌的常用方法是用Ca2＋處理法.③目的基因能夠在植株細胞內穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性的關鍵是目的基因是否插入到受體細胞染色體DNA上。④由棉株細胞形成抗蟲棉需要植物組織培養(yǎng)技術。質粒和重組質粒是兩個不同概念，插入目的基因的質粒，稱為重組質粒。4．目的基因的檢測與鑒定檢測內容檢測方法備注外源DNA是否插入受體細胞染色體上DNA分子雜交從轉基因生物體內提取DNA，用同位素或者熒光分子標記的目的基因與之雜交目的基因是否轉錄出mRNA核酸分子雜交從轉基因生物體內提取mRNA，用標記的目的基因與之雜交目的基因是否翻譯出蛋白質分子水平：抗原—抗體雜交從轉基因生物體內提取蛋白質與相應抗體雜交個體水平：生物學功能鑒定抗蟲、抗病的接種實驗，與普通生物進行比較，檢測是否有差異題型一cDNA的形成和PCR擴增的有關問題【例1】1970年,特明和巴爾的摩證實了RNA病毒能依賴RNA合成DNA的過程，并發(fā)現了催化此過程的酶.下面為形成cDNA的過程和PCR擴增過程示意圖。請根據圖解回答下列問題。(1）催化①過程的酶是________；核酸酶H的作用是________。（2)③過程也稱為DNA的變性，此過程在溫度高達90～95℃時才能完成，(3）由圖中信息分析可知，催化②⑤過程的酶都是________,兩者在作用特性上的區(qū)別是________。（4）如果RNA單鏈中有堿基100個，其中A占25％，U占15％，則通過該過程合成的一個雙鏈DNA片段中有胞嘧啶________個。解析：根據圖示可以看出，該過程是RNA在逆轉錄酶的催化作用下形成cDNA（負鏈DNA)，構成RNA—DNA中間體。中間體中的RNA再經過RNA酶H水解，而以剩下的負鏈DNA復制成雙鏈DNA的過程。①過程是由RNA合成DNA的過程，需要逆轉錄酶進行催化。②過程是以單鏈DNA復制獲得雙鏈DNA的過程需要DNA聚合酶催化。⑤屬于雙鏈DNA復制的過程，需要DNA聚合酶催化。⑤過程在70～75℃環(huán)境下進行,所需要的酶應該能夠耐高溫。答案：（1）反轉錄酶（或逆轉錄酶）分解RNA(2）穩(wěn)定（3）DNA聚合酶催化⑤過程的酶耐高溫（4)60題型二基因工程操作的具體步驟【例2】（2010·江蘇卷）下表中列出了幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中箭頭表示相關限制酶的酶切位點。請回答下列問題。限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠSmaⅠ識別序列及切割位點圖1圖2（1）一個圖1所示的質粒分子經SmaⅠ切割前后,分別含有________個游離的磷酸基團。（2）若對圖中質粒進行改造，插入的SmaⅠ酶切位點越多,質粒的熱穩(wěn)定性越________.（3）用圖中的質粒和外源DNA構建重組質粒,不能使用SmaⅠ切割，原因是________________________________________________________________________。(4)與只使用EcoRⅠ相比較，使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質粒、外源DNA的優(yōu)點在于可以防止____________________。（5）為了獲取重組質粒，將切割后的質粒與目的基因片段混合，并加入________酶。（6）重組質粒中抗生素抗性基因的作用是為了__________________________.解析:（1）切割前質粒為環(huán)狀,不含游離的磷酸基團。切割后質粒成了一個鏈狀的雙鏈DNA分子，含兩個游離的磷酸基團。（2）因為SmaⅠ識別序列中均為G—C堿基對，G、C之間含三個氫鍵,熱穩(wěn)定性高。（3）據題圖可知,SmaⅠ既會破壞標記基因，也會破壞目的基因。（4）若用同種限制性內切酶切割質粒和外源DNA中的目的基因，因為兩端的黏性末端能夠互補配對，會出現自身環(huán)化的情況。而用兩種限制性內切酶切割，因為兩端形成的黏性末端不能夠互補配對，不會出現自身環(huán)化.(5）DNA連接酶可以連接具有能夠互補配對黏性末端的DNA片段。（6）標記基因可以鑒別受體細胞是否含有目的基因。答案：(1）0、2(2）高（3）SmaⅠ會破壞質粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因（4）質粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化（5）DNA連接（6）鑒別和篩選含有目的基因的細胞1．下列有關基因工程操作的順序組合中正確的是（）。①目的基因的檢測與鑒定②基因表達載體的構建③將目的基因導入受體細胞④目的基因的獲取A．①②③④ B．④③②① C．④②③① D．③④②①2．下列有關PCR技術的敘述正確的是().A．作為模板的DNA序列不能在每一次擴增中重復使用B．作為引物的脫氧核苷酸序列不能在每次擴增中重復使用C．反應需要的DNA聚合酶不能在每次擴增中重復使用D．反應需要的DNA連接酶不能在每次擴增中重復使用3．下列不屬于基因表達載體的組成部分的是（)。A．啟動子 B．終止密碼 C．標記基因 D．目的基因4．欲使目的基因迅速表達基因產品，最好將目的基因導入(）.A．植物細胞 B．細菌或真菌細胞 C．動物細胞 D．病毒5．在判斷抗蟲基因是否成功轉入棉花基因組的方法中，不屬于分子檢測的是()。A．通過觀察害蟲吃棉葉是否死亡B．檢測目的基因片段與DNA探針能否形成雜交帶C．檢測目的基因轉錄形成的mRNA與DNA探針能否形成雜交帶D．檢測目的基因表達產物蛋白質能否與特定抗體形成雜交帶答案：1．C2．BPCR中模板DNA序列可反復在每一次循環(huán)中用作模板;反應過程中需要的DNA聚合酶可重復使用；反應不需要DNA連接酶；而每一次循環(huán)用到的引