PAGE6-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段(30分鐘100分)一、選擇題(共4小題,每小題9分,共36分)1.下列有關(guān)PCR技術(shù)的敘述,正確的是 ()A.作為模板的DNA序列必需不斷地加進每一次的擴增當(dāng)中B.作為引物的脫氧核苷酸序列必需不斷地加進每一次的擴增當(dāng)中C.反應(yīng)須要的DNA聚合酶必需不斷地加進反應(yīng)當(dāng)中D.反應(yīng)須要的DNA連接酶必需不斷地加進反應(yīng)當(dāng)中【解析】選B。模板DNA只須要加入一次,A項錯誤;引物在合成過程中不斷被利用,須要不斷加入,B項正確;DNA聚合酶可反復(fù)運用,C項錯誤;PCR技術(shù)中用到耐熱的DNA聚合酶,D項錯誤。2.PCR技術(shù)又稱為多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),現(xiàn)在已經(jīng)成為分子生物學(xué)試驗室的一種常規(guī)手段,它可以在體外很短的時間內(nèi)將DNA大量擴增。你認(rèn)為下列符合在體外進行PCR反應(yīng)條件的一組是 ()①穩(wěn)定的緩沖液環(huán)境②DNA模板③合成引物④四種脫氧核苷酸⑤DNA聚合酶⑥D(zhuǎn)NA解旋酶⑦限制性核酸內(nèi)切酶⑧溫控設(shè)備A.①②③④⑤⑥B.①②③④⑤⑥⑦⑧C.③④⑤⑥⑧D.①②③④⑤⑧【解析】選D。在PCR技術(shù)中,須要的條件有模板、引物、四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶,此外還須要相宜的溫度和pH,故D正確。3.下列對PCR操作過程的敘述,錯誤的是 ()A.PCR反應(yīng)中運用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在運用前必需進行高壓滅菌B.PCR所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份,并在-20℃儲存C.PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后,快速溶化D.在微量離心管中添加反應(yīng)成分時,每吸取一種試劑后,移液器上的吸液槍頭都必需更換【解析】選C。為了避開外源DNA等因素的污染,PCR反應(yīng)中運用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在運用前必需進行高壓滅菌;PCR所用的緩沖液及酶應(yīng)分裝成小份保存,并運用一次性吸液槍頭。在冰箱中放置的緩沖液和酶取出后應(yīng)放在冰塊上緩慢溶化,而不能快速溶化。4.下列關(guān)于PCR引物的說法,不正確的是 ()A.引物是PCR過程中與模板DNA部分序列互補,并能引導(dǎo)模板DNA的互補鏈合成的核苷酸序列B.引物常依據(jù)須要擴增的目標(biāo)DNA的堿基序列用化學(xué)合成的方法獲得C.PCR過程中須要一種引物或兩種引物D.引物的3′端具有游離的—OH【解析】選C。由于DNA聚合酶不能從頭合成DNA鏈,因此引物是PCR過程中與模板DNA部分序列互補,并能引導(dǎo)模板DNA的互補鏈合成的核苷酸序列,A項正確。PCR擴增的DNA片段取決于兩種引物的結(jié)合位點,因此所用的引物通常是依據(jù)須要擴增的目標(biāo)DNA的堿基序列用化學(xué)合成的方法獲得,B項正確,C項不正確。引物的3′端具有游離的—OH,D項正確。二、非選擇題(共4小題,共64分)5.(12分)在進行DNA親子鑒定時,需利用PCR技術(shù)(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))使樣品DNA擴增,獲得大量DNA克隆分子。該技術(shù)的原理是利用DNA的半保留復(fù)制,在試管中進行DNA的人工復(fù)制(如圖,圖中黑色短線是引物)。回答下列問題:(1)圖中的變性、延長分別是指______________________________、

____________________。

(2)假設(shè)PCR反應(yīng)中的DNA模板為P,第一輪循環(huán)的產(chǎn)物2個子代DNA為N1,其次輪循環(huán)的產(chǎn)物4個子代DNA為N2,N1、N2中分別含有模板DNA單鏈的DNA有______個、______個。若接著循環(huán),該DNA片段經(jīng)過30次循環(huán)后能形成________個DNA片段。

(3)某樣品DNA分子中引物之間的序列共含3000個堿基對,堿基數(shù)量滿意,若經(jīng)過5次循環(huán),至少須要向試管中加入________個腺嘌呤脫氧核苷酸。(不考慮引物所對應(yīng)的片段)

【解析】(1)PCR技術(shù)中DNA變性是指作為模板的DNA雙鏈解旋形成單鏈。延長是指在DNA聚合酶的作用下,原料脫氧核苷酸聚合形成新的DNA鏈。(2)由于DNA為半保留復(fù)制方式,因此不管復(fù)制幾次,子代中始終有2個DNA含有模板DNA單鏈。DNA復(fù)制,子代以指數(shù)形式“2n”增長,n=復(fù)制次數(shù),故復(fù)制30次形成230個DNA片段。(3)在雙鏈DNA分子中,A=T,G=C,由推出,所以C=2A①;A+C=堿基總數(shù)②,將①式代入②式得A=1000。1個DNA分子復(fù)制5次,增加了25-1=31(個)DNA分子,故至少須要1000×31=31000個腺嘌呤脫氧核苷酸。答案:(1)模板DNA雙鏈解旋形成單鏈在DNA聚合酶的作用下,原料脫氧核苷酸聚合形成新的DNA鏈(2)22230(3)310006.(14分)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外快速擴增DNA片段的技術(shù)。請回答下列有關(guān)PCR技術(shù)的基本原理及應(yīng)用問題。(1)DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?通常將________的末端稱為5′端,當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后,DNA聚合酶就能從引物的________起先延長DNA鏈。

(2)PCR利用DNA的熱變性原理解決了打開DNA雙鏈的問題,但又導(dǎo)致了DNA聚合酶失活的新問題。到20世紀(jì)80年頭,科學(xué)家從一種Taq細(xì)菌中分別到________________,它的發(fā)覺和應(yīng)用解決了上述問題。要將Taq細(xì)菌從其他一般的微生物中分別出來,所用的培育基叫________________。

(3)PCR的每次循環(huán)可以分為________________三步。假設(shè)在PCR反應(yīng)中,只有一個DNA片段作為模板,請計算在5次循環(huán)后,反應(yīng)物中大約有________個這樣的DNA片段。

【解析】(1)DNA聚合酶只能把新的核苷酸加到已經(jīng)存在的核酸的3′羥基上,與DNA母鏈結(jié)合的RNA引物就供應(yīng)這個羥基。(2)因為PCR利用了DNA的熱變性原理解決了打開DNA雙鏈的問題,所以用于催化DNA復(fù)制過程的DNA聚合酶要具有耐高溫的特性。用選擇培育基可將Taq細(xì)菌從其他一般的微生物中分別出來。(3)DNA復(fù)制時兩條鏈均作為模板,進行半保留復(fù)制,所以復(fù)制5次后得到的子代DNA分子數(shù)為25=32個。答案:(1)磷酸基團3′端(2)耐高溫的TaqDNA聚合酶選擇培育基(3)變性、復(fù)性和延長327.(18分)如圖表示PCR的反應(yīng)過程,請據(jù)圖回答相關(guān)問題。(1)在相應(yīng)的橫線上寫出引物Ⅱ,并在復(fù)性這一步驟中將引物Ⅱ置于合適的位置。(2)在相應(yīng)的橫線上寫出循環(huán)一次后生成的DNA分子。(3)若將作為原料的4種脫氧核苷酸用32P標(biāo)記,請分析循環(huán)一次后生成的DNA分子的特點:____________________,循環(huán)n次后生成的DNA分子中不含放射性的單鏈占總單鏈的比例為____________。

(4)PCR反應(yīng)過程的首要條件是____________,PCR技術(shù)利用DNA的__________原理解決了這個問題。

(5)在對樣品DNA分析過程中發(fā)覺,DNA摻雜著一些組蛋白,要去除這些組蛋白可加入的物質(zhì)是________________。

【解析】(1)引物的作用是供應(yīng)DNA聚合酶的起點3′端,引物Ⅰ與b鏈相應(yīng)的堿基配對,引物Ⅱ應(yīng)與a鏈相應(yīng)的堿基配對,留意引物與母鏈?zhǔn)欠聪虻摹?2)DNA體外擴增同細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制一樣都是半保留復(fù)制,DNA分子的兩條母鏈分別作為模板,合成新的DNA鏈。(3)因為新合成的DNA分子是一條母鏈與一條子鏈結(jié)合,因此每個DNA分子一條鏈(子鏈)有32P,另一條鏈(母鏈)有31P。循環(huán)n次后得到2n個DNA分子,共2n+1條單鏈,其中第一代的兩條DNA鏈都是31P,不含放射性的單鏈占總鏈的1/2n。(4)PCR反應(yīng)首先須要DNA解旋,體外DNA解旋利用了DNA熱變性的原理。(5)加入蛋白酶可水解組蛋白,而DNA不受影響,這利用了酶的專一性原理。答案:(1)5′—G—A—OHHO-A-G-5′5′-G-G……T-C-3′(2)3′—C—C……A—G—5′5′—G—G……T—C—3′5′—G—G……T—C—3′3′—C—C……A—G—5′(3)每個DNA分子各有一條鏈含32P1/2n(4)DNA解旋熱變性(5)蛋白酶8.(20分)PCR技術(shù)是基因工程中獲得目的基因的常用方法,請分析回答下列有關(guān)問題:(1)利用PCR技術(shù)擴增目的基因,其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似(如圖所示)。圖中引物為單鏈DNA片段,它是子鏈合成延長的基礎(chǔ)。①從理論上推想,第四輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為__________________。

②在第________________輪循環(huán)產(chǎn)物中起先出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。

(2)設(shè)計引物是PCR技術(shù)的關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計的兩組引物(只標(biāo)注了部分堿基序列)都不合理(如圖),請分別說明理由。①第1組:____________________________________________;

②第2組:____________________________________________。

(3)PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶,下面的表達(dá)式不能正確反映DNA聚合酶的功能,這是因為____________________________________________________________________________。

【解析】(1)①以原來的每條母鏈為模板合成的兩個新DNA分子中,只含有引物A或引物B,而以新合成的子鏈為模板合成的新DNA分子中,兩種引物都含有,故第四輪循環(huán)共產(chǎn)生16個DNA分子,其中只含有引物A、引物B的DNA分子各1個。同時含有引物A和引物B的DNA分子有14個,因此含有引物A的分子是15個,占15/16。②第一、二個循環(huán)合成的子鏈長度均不同,依據(jù)半保留復(fù)制特點可知,前兩次循環(huán)產(chǎn)生的四個DNA分子的兩條脫氧核苷酸鏈均不等長,第三個循環(huán)產(chǎn)生的DNA分子存在等長的兩條脫氧核苷酸鏈。(2)在第1組引物中,引物Ⅰ的部分堿基序列是CAGGCT,引物Ⅱ的部分堿基序列是AGCCTG,若利用這兩個引物進行DNA擴增,會因其中部分堿基發(fā)生堿基互補配對而使該組引物失效。在第2組引物中,引物Ⅰ′的部分堿基序列是AACTG和CAG