第十四章附肢的發育和再生第十四章_附肢的發育和再生概述附肢發育的研究是發育生物學的一個重要課題。脊椎動物，特別是鳥類和兩棲類附肢（limb）的發育包含了大量的、各種各樣的誘導作用。有尾類的蠑螈和美西螈附肢具有明顯的再生能力，是研究再生的極好模型。第十四章_附肢的發育和再生第一節脊椎動物附肢的發育脊椎動物的附肢是一個極其復雜的器官，每一塊骨和肌肉的位置都被精密地組織在一起。附肢在三個基本軸上是不對稱的，但左前肢總是和右前肢呈鏡面對稱。脊椎動物的附肢都是由體壁中胚層和外部表皮共同組成。第十四章_附肢的發育和再生雞翅內骨的排列模式及其不對稱性第十四章_附肢的發育和再生孵化10天的完整雞翅標本示三個發育軸：近側-遠側軸、前后軸及背腹軸。前部的后部的近側的遠側的背側的腹側的第十四章_附肢的發育和再生在所有的四足動物中，附肢發育的基本形態發生原則是相同的。構建一個附肢所需要的位置信息要在一個三維（或包括時間在內的四維）的、相互協調的系統中發揮作用。現在已鑒定了一系列蛋白，在附肢近遠軸、前后軸和背腹軸的形成過程中發揮作用。第十四章_附肢的發育和再生一、附肢的起源脊椎動物的附肢在起源上是由胚胎體壁向外生長形成的，主要是由來自中胚層的疏松間質形成的中央核，以及來自外胚層的表皮兩大部分組成。附肢的原基稱為附肢芽（limbbud）。附肢芽形成的位置在每一物種是恒定的，由Hox基因沿身體前后軸表達的水平決定。第十四章_附肢的發育和再生雞胚胎的肢芽孵化后第三天胚胎的側面出現肢芽。翅肢芽腿肢芽頂外胚層嵴體節第十四章_附肢的發育和再生附肢域能形成一個附肢的所有細胞，稱為附肢域（limbfield）或附肢場。附肢域包括位于中央的、產生附肢本身的中胚層細胞（附肢盤，limbdisc）以及形成周圍的軀干組織和肩帶/腰帶細胞。附肢域起初具有調節失去或增加部分附肢的能力，附肢域中的每個細胞都能被指令形成附肢的任意一部分-調和等能系統。第十四章_附肢的發育和再生美西螈（Ambystomamaculatum）的預定前肢場第十四章_附肢的發育和再生第十四章_附肢的發育和再生視黃酸RA對于肢芽的向外生長具有重要的意義。用藥物阻斷RA的合成，將抑制肢芽最初的形成。A，RA處理蝌蚪的尾巴引起肢的再生；C，RA處理促進肢芽的形成（箭頭所指部位）。第十四章_附肢的發育和再生二、附肢的早期發育附肢早期發育的第一個跡象：預定形成附肢的細胞從附肢域側板中胚層（附肢骨骼的前體）和體節中胚層（附肢肌肉的前體）分離出來，轉變成一團間質細胞，這些間質細胞向側面遷移到側板中胚層和表皮之間，牢固地貼附于表皮內表面。第十四章_附肢的發育和再生兩棲類胚胎中附肢由中胚層起源的圖解肢芽第十四章_附肢的發育和再生肢芽覆蓋在間質細胞團表面的表皮變得稍微增厚，同時被包裹在內部的間質細胞團向外突出，形成肢芽（limbbud）。肢芽中胚層細胞第十四章_附肢的發育和再生成纖維細胞生長因子FGF10形成預定附肢間質細胞中的側板中胚層細胞提供肢芽形成的信號，這些細胞分泌的FGF10能夠啟動上皮和中胚層細胞之間的相互作用。含有FGF10的磁珠（bead）異位放置于上皮下方，會誘導出額外的肢芽。第十四章_附肢的發育和再生FGF10的表達及其在雞肢發育過程中的作用第十四章_附肢的發育和再生三、前肢和后肢的特化Gain-of-function實驗結果表明，轉錄因子TBX4和TBX5分別與后肢和前肢的特化有關。Loss-of-function資料也表明，人類TBX5基因缺失會導致上肢和心臟的異常，但下肢基本不受影響。第十四章_附肢的發育和再生TBX4和TBX5在肢型特化中的作用第十四章_附肢的發育和再生TBX4和TBX5在FGF10誘導形成的肢芽中的表達第十四章_附肢的發育和再生異位表達TBX4，可以使FGF10誘導形成的前肢轉變為后肢第十四章_附肢的發育和再生四、頂外胚層嵴的形成隨著鳥類和哺乳類的中胚層間質細胞進入肢區，它們分泌的因子誘導肢芽頂端前、后邊緣的外胚層細胞伸長，形成一個增厚的特殊結構，稱為頂外胚層嵴（apicalectodermridge，AER）。AER是一個臨時的結構，對于附肢的繼續向外生長是至關重要的。第十四章_附肢的發育和再生間質細胞分泌的因子可能是FGF10，其他的FGF因子如FGF2、FGF4和FGF8雖然也可以誘導AER的形成，但FGF10合成的時間和位置都是適當的。FGF10能夠誘導雞胚背腹交界處的外胚層形成AER。在背部化的肢芽突變體中，由于沒有背腹交界，便不能形成AER。第十四章_附肢的發育和再生掃描電鏡觀察孵化4.5天的雞胚肢芽顯示頂外胚層嵴AER背側腹側第十四章_附肢的發育和再生附肢發育中外胚層和中胚層間的相互作用

附肢的向外生長涉及AER和中胚層間持續的相互作用。一旦中胚層誘導其上方的外胚層形成AER，AER與中胚層的相互作用對附肢的向外生長是最重要的。中胚層在附肢發育中也起著關鍵的作用。AER起初的形成和繼續存在依賴于位于其下方的中胚層。第十四章_附肢的發育和再生AER與位于其下的中胚層的相互作用①在附肢發育期間任何時間除去AER，遠端附肢的進一步發育停止。②當額外的AER移植到附肢芽上將形成超數附肢結構，通常朝向附肢遠端。③將腿間質直接置于翅的AER下方，遠端的后肢結構（趾）在附肢末端發育（然而，如果腿間質離AER較遠，后肢間質進入翅的結構）。④當非附肢的中胚層移植到AER下方，則AER退化，附肢發育停止。①②③④第十四章_附肢的發育和再生附肢發育中外胚層和中胚層間的相互作用附肢發育中至少要求三種類型的外胚層和中胚層間的相互作用：第一，中胚層起始附肢芽向外生長和形成AER；第二，AER進一步刺激肢芽的向外生長以及肢芽中胚層的增殖和分化；第三，附肢芽中胚層提供保持AER所必須的刺激。第十四章_附肢的發育和再生五、附肢發育時期軸的建立脊椎動物完全形成的附肢包含三個軸的發育：近遠軸（proximal-distal,P-D）、背腹軸（dorsal-ventral，D-V）和前后軸（anterior-posterior,A-P）。附肢發育中三個軸的建立具有各自的時間性，它們好像是按下列順序決定的：前后軸、背腹軸和近遠軸。第十四章_附肢的發育和再生1.近遠軸的發育附肢沿近遠軸的分化：由AER和附肢中胚層誘導的相互作用產生的。附肢芽的逐漸向外生長：①由于位于AER下面間質細胞的增殖；②AER釋放的分子（成纖維細胞生長因子FGF）維持間質細胞不斷進行分裂。由AER合成、釋放到其下的間質中的成纖維細胞生長因子FGF可能是雞胚中維持間質細胞增殖的分子。第十四章_附肢的發育和再生AER和附肢芽中胚層的相互作用第十四章_附肢的發育和再生外胚層嵴頂端對于肢芽近遠軸圖式的發育是必須的。從正在發育的肢芽中去除AER，將導致肢芽生長的停止；在發育后期將AER去除，可得到較為完整的肢。

第十四章_附肢的發育和再生生長因子可以替代頂外胚層嵴將AER切除后，移植能釋放生長因子FGF-8的玻璃珠，可使肢幾乎正常發育。第十四章_附肢的發育和再生背腹軸的分化在雞翅中，沿背腹軸有一很清晰的圖式。背腹軸的組成部分是由早期雞胚胎預定肢芽區域的外胚層決定，并在背腹軸之間發育形成頂外胚層嵴。在突變小鼠中控制著脊椎動物肢的背腹軸的基因已經被確定。Wnt-7a基因在肢背部中胚層圖示形成中起到關鍵作用。2.背腹軸的分化第十四章_附肢的發育和再生從體節發出的信號參與背部外胚層的確定。在雞翅芽中，背腹外胚層界線的建立明顯有來看Notch受體信號的參與。含有homeobox的基因Engrailed-1在AER形成之前就已經在附肢腹部的外胚層特異地表達，有可能特化為將來的腹部區域。第十四章_附肢的發育和再生外胚層控制發育中肢的背腹軸圖式的形成。Wnt-7a在背部外胚層中表達，而Engrailed基因在腹部外胚層中表達。lmx-1基因在背中胚層中被Wnt-7a誘導表達，并且參與背部結構的確定。

第十四章_附肢的發育和再生3.前后軸的特化附肢芽前后軸的極性：在肢芽能識別之前就已特化。有兩種主要模型用來解釋前后軸的特化。一種是極化活動區（zoneofpolarizingactivity，ZPA）可擴散形態發生子模型（ZPAdiffusiblemorphogenmodel）。另一種是極性坐標模型（thepolarcoordinatemodel）。第十四章_附肢的發育和再生六、同源基因在附肢發育中的作用

現代研究認為附肢是通過特異基因在特定細胞中的表達決定的，同源基因可用于解釋附肢發育中的所有主要現象。同源基因決定附肢場附肢場的邊界與誘導能力有關，而此邊界是由同源基因的表達模式決定的。第十四章_附肢的發育和再生漸進帶的相互作用是由msx-1和msx-2基因調節的

AER和位于其下的間質的相互作用是由msx-1和msx-2基因產物調節的。msx-1基因起初在整個早期的附肢芽中表達，但此后變得局限于直接位于AER下方的漸進帶間質中表達。msx-2基因起初是在AER和前部的間質中的表達。第十四章_附肢的發育和再生由同源基因決定前后軸和指的特性HoxD基因家族（Hoxd-9到Hoxd13）的表達模式在小鼠附肢芽的后部邊緣是重疊的。這意味著在后部邊緣產生小指的細胞表達所有這些基因，而在前部邊緣形成拇指的細胞只表達Hoxd-9。顯然，在不同Hox-D基因的表達中存在一個編碼特化前后指的模式。第十四章_附肢的發育和再生七、細胞死亡與指和關節的形成脊椎動物附肢中特定細胞的死亡是可遺傳的程序性細胞死亡，是進化過程中經自然選擇形成的。細胞死亡在指/趾的成形過程中，特別是關節形成和手指的分離中起著重要的作用。第十四章_附肢的發育和再生鴨胚和雞胚后肢原基中細胞死亡模式的比較。第十四章_附肢的發育和再生雞胚趾間細胞的程序性死亡信號可能由BMP發出，封阻BMP的受體將會阻止這些細胞的程序性死亡。nogginexpressiondominantn