專題突破10綜合PCR的基因工程問題

闡述常規PCR、重疊延伸PCR、熒光定量PCR等的過程與原理，舉例說明不

課標要求

同的PCR技術有著不同的應用。

2023?江蘇-T222023?山東-T252022?江蘇-T24

2022?山東-T25

考情分析幾種不同PCR的應用

2021?全國甲?T382021?山東-T252020?北京-T12

2020?江蘇-T33

類型一利用PCR技術獲取目的基因

【基本模型】

獲取目的基因是基因工程操作的第一步。獲取目的基因的方法有多種，現在常用PCR特異性

地快速擴增目的基因。PCR是聚合酶鏈式反應的縮寫。它是一項根據DNA半保留復制的原

理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核昔酸序列進行大量

復制的技術。該技術由穆里斯等人于1985年發明，為此，穆里斯于1993年獲得了諾貝爾化

學獎。

【典例突破】

1.“X基因”是DNA分子上一個有遺傳效應的片段，若要用PCR技術特異性地拷貝“X

基因”，需在PCR反應中加入兩種引物，兩種引物及其與模板鏈的結合位置如圖1所示。下

列敘述錯誤的是（）

引■物1引?物2

3'--------讓------1-1--------5'

5,--------1------------U----3'

'X-因

圖1

3'

圖2

A.第一輪復制得到2個DNA分子，即①②各一個

B.第二輪復制得到4個DNA分子，即①②③④各一個

C.第四輪復制得到16個DNA分子，其中有4個X基因

D.經五輪循環后產物中有五種不同的DNA分子

答案C

解析據圖分析可知，第一輪復制形成2個DNA分子，即①②各一個，A正確；第二輪復

制得到22=4（個）DNA分子，即①復制得①和③、②復制得②和④，即得到①②③④各一個,

B正確；第四輪復制得到16個DNA分子，其中有8個⑤（X基因），C錯誤；經五輪循環后

共形成32個DNA分子，其中①②各一個，③④各四個，22個⑤，故產物中有五種不同的

DNA分子，D正確。

類型二利用PCR技術鑒定目的基因的連接方式

【基本模型】

檢測目的基因在受體細胞內是否穩定存在是基因工程操作的重要步驟，可以借助載體上的標

記基因、PCR技術和核酸分子雜交技術等方法鑒定受體細胞中是否轉入了目的基因。在實際

操作中，PCR技術不僅可以精準地鑒定受體細胞是否轉入目的基因，還可以通過引物的巧妙

設計鑒定目的基因的連接方式。

【典例突破】

2.（2019?江蘇，33節選）為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質粒，擬

設計引物進行PCR鑒定。圖示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質粒中的相應位置，PCR

鑒定時應選擇的一對引物是o某學生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質粒中

擴增出了400bp片段，原因是o

答案乙、丙目的基因反向連接

解析分析題圖可知，理論上可以選擇的引物組合有甲和丙、乙和丙兩種情況。如果選擇甲

和丙這對引物，則無論目的基因是否正確插入，擴增的片段都是50+300+100=450（bp）,不

符合要求；如果選擇乙和丙這對引物，正向連接和反向連接后所得結果不同，所以應選擇乙

和丙這對引物進行PCR鑒定。如果目的基因和質粒反向連接，則引物乙會出現在重組質粒的

外側，此時若加入引物甲和乙，則可以擴增出300+100=400（bp）的片段。

類型三利用PCR技術引導基因定點突變

【基本模型】

重疊延伸PCR技術是指在PCR技術的基礎上，采用具有互補末端的引物，使PCR產物形成

了重疊鏈，通過重疊鏈的延伸，將不同來源的片段重疊拼接起來的一項新技術。該技術在基

因的定點突變、長片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴增等方面有著獨特的應用。

【典例突破】

3.水蛭素是一種蛋白質，可用于預防和治療血栓。某科研團隊運用重疊延伸PCR技術在水

蛭素基因中的特定位點引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密碼子為AAC、AAU）

替換為賴氨酸（密碼子為AAA、AAG）,從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如圖。

,擬突變位點

5'-----------------A------------------3'

3'——引幽4

引物2二5

3

Mr5

二-

35

5-——T---------------5，3，--------------T

階-3'I使用引物1和‘小中3

弓_

隊-2進行PCRSgpCR

/

,5-3

3/個3'、,5'」5

第人④一一一3口

二

一I混合、變性后，雜交

階

段5'-------------5，

|首先使用DNA聚合酶延伸，

|然后使用引物1和4進行PCR

5'------------------A---------------3'

3,------------------A--------------5，

突變后的基因

注：圖中的引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補的突變位點。

（1）由以上事例可知，要對蛋白質的結構進行改造，需要通過來完成。

（2）若擬突變位點的堿基對為A—T,則需要讓其突變為才能達到目的。引物2

的突變位點（突起處）應設計為（假設引物為單鏈DNA）。

（3）在第一階段獲得2種具有重疊片段DNA的過程中，引物1、引物2組成的反應系統和引

物3、引物4組成的反應系統中均進行一次復制，共產生一種DNA分子。該階段必須將引

物1、2和引物3、4置于不同反應系統中，這是因為

O

（4）利用重疊延伸PCR技術還可以將兩個不同來源的DNA片段拼接起來。有人想利用該技術

把基因M和N拼接在一起，設計基因M的引物Mi、M2,基因N的引物Ni、N2=在設計這

4種引物時，特別要注意的問題是____________________________________________________

答案（1）改造基因（或基因定點突變）（2）T—A或C—GA或G（3）3引物2和3中存在

互補配對片段，置于同一反應系統時會結合而失去作用

（4）Mi、M2中的一種引物與Ni、N2中的一種引物必須具有互補配對的片段

解析（2）若擬突變位點的堿基對為A—T,則需要讓其突變為T—A或C—G,對應的密碼子

由AAU變成AAA或由AAC變成AAG,可使天冬酰胺替換為賴氨酸。（3）若兩個反應系統

均進行一次復制，則會產生3種不同的DNA分子，因為引物1和4產生的DNA分子是一

樣的。（4）重疊互補引物的設計是重疊延伸PCR技術成功的關鍵。拼接基因M和N時，設計

引物時需要注意的是，需要找到兩種基因的重疊部分，即Mi、M2中的一種引物與Ni、N2

中的一種引物必須具有互補配對的片段。

類型四利用PCR技術擴增未知基因序列

【基本模型】

利用PCR技術進行基因擴增時，為了便于設計引物，要求目的基因兩側的序列是已知的。當

DNA的某些序列已知，而需要擴增已知序列兩端的未知序列時，可采用反向PCR技術。

【典例突破】

4.（2020?江蘇，33節選）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出

已知序列兩側的序列，具體流程如圖（以EcoRI酶切為例）：

染色體DNA

［酶切|空隋領圜

昆合的DNA片段

y-------7'^2,

」未知序歹!H已知序列I未知序列片段F

n連接［DNA連接酶

已知序列、

DI擴增1"gDNA聚合酶

--------■PCR產物

IV測序、分析［片段F的

5'...........................................................3,完整序列

請據圖回答問題：

⑴步驟I用的EcoRI是一種酶，它通過識別特定的切

割特定位點。

⑵步驟II用的DNA連接酶催化相鄰核甘酸之間的3,一羥基與5'—磷酸間形成

;PCR循環中，升溫到95℃是為了獲得；ThqDNA聚合酶

的作用是催化

（3）若如表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物，步驟III選用的PCR引物必須是

（從引物①②③④中選擇，填編號）。

DNA序列（虛線處省略了部分核甘酸序列）

5^-AACTATGCGCTCATGA----GCAATGCGTAGCCTCT-3'

已知序列11111111111111111111111111111111

3^-TTGATACGCGAGTACT----CGTTACGCATCGGAGA-5'

①5'-AACTATGCGCTCATGA-3'

②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3z

PCR引物

③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'

④5'—TCATGAGCGCATAGTT-3'

答案（1）限制性內切核酸（或限制）核甘酸序列

⑵磷酸二酯鍵DNA單鏈以DNA為模板的DNA鏈的延伸（3）②④

解析（3）PCR過程中，根據已知的DNA序列合成兩個引物，要注意模板鏈和引物的方向是

相反的，引物的核甘酸序列要能夠和相應模板的核甘酸序列發生堿基互補配對，環狀DNA

圖中顯示PCR過程是從已知DNA序列的兩端分別向相反方向形成子鏈，一個引物是與已知

DNA序列的第一條鏈的左端互補結合，向右側方向延伸形成子鏈，該引物是④，另一個引物

是與已知DNA序列的第二條鏈的右端互補結合，向左側方向延伸形成子鏈，該引物是②。

類型五利用PCR技術快速檢測病原體

【基本模型】

病原體檢測是診斷和控制傳染病的重要手段，為迅速而準確地確定病原體的存在和種類，發

展了許多快速檢測方法。PCR技術是一種基于DNA擴增原理的快速病原體檢測方法，它能

夠在幾小時內擴增和檢測極小量的病原體DNA,并且具備高度的特異性和敏感性。

【典例突破】

5.（2024?煙臺高三一模）人類猴痘由Yaba猴病毒（雙鏈DNA病毒）引起，實時熒光定量

PCR（qPCR河用于Yaba猴病毒的快速檢測。進行qPCR時，在反應體系加入Kzgman探針，

2qman探針兩端連有熒光基團（R）和抑制熒光發出的淬滅基團（Q）,完整的Zqman探針不發

出熒光，當探針被水解后R基團會發出熒光（如圖所示），隨循環次數的增加，熒光信號強度

增加。

⑴采用qPCR檢測Yaba猴病毒需在一定的溶液中才能進行，反應體系中還需提

供DNA模板、原料、、Thqman探針、ZgDNA聚合酶、Mg2+等。qPCR過程中，

TaqDNA聚合酶的兩個作用是=

⑵qPCR檢測病毒的核酸一般具有特異性強和靈敏度高的特點，這與反應體系中加入的

和有關。但有時也可能會出現“假陰性”的結果?？赡艿脑蛴?/p>

_______________________________________________________________________（答出兩點）。

（3）在PCR反應體系中一般都要加入Mg2+,原因是o為了探

究Mg2+對PCR擴增效果的影響，科研人員在PCR反應體系中加入不同濃度的Mg2+進行了

實驗。結果如圖所示，據此可得出的結論有

⑥

22④

⑤

L8②

L4①

L0

S6

一（）21~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~?~*■

048121620242832364044

循環次數

注:①?⑤乂名?+濃度分別為2、3、4、5,6mM;

⑥為陰性對照。

答案（1）緩沖引物催化合成DNA子鏈；催化探針水解（2）引物探針取樣不規范；

取樣所獲樣本量不足;病毒發生了基因突變（3）7hgDNA聚合酶需要Mg2+激活在不含Mg2

+的緩沖液中靶基因幾乎無法擴增；在不同濃度的Mg2+緩沖液中靶基因的擴增效果不同；在

實驗濃度下，4mM為最佳濃度

解析（3）真核細胞和細菌的DNA聚合酶（ThqDNA聚合酶）都需要Mg2+激活；分析題圖可知,

⑥為陰性對照組，其熒光強度非常弱，意味著不加Mg2+的緩沖液中靶基因幾乎無法擴增；

而加了不同濃度的Mg?+的緩沖液對應的曲線①②③④⑤熒光強度均高于⑥，且③曲線（Mg?+

濃度為4mM）的峰值對應的熒光強度最高，說明在不同濃度的Mg?+緩沖液中靶基因的擴增效

果不同；在實驗濃度下，4mM為最佳濃度。

課時精練

一、選擇題

1.（2024?廈門高三質檢）如圖表示PCR過程中某個階段反應體系的情況，①②③④表示相關

物質，L、R表示方向。下列敘述正確的是（）

A.②鏈從L到R的方向為3'-5',①②鏈均可作為子鏈合成的模板

B.PCR過程需要通過解旋酶斷開氫鍵，且為邊解旋邊復制

C.以1個DNA為模板經3次循環需消耗8個引物③

D.物質③的5,端添加了某序列，至少需經2次循環才可獲得該序列的雙鏈產物

答案D

解析根據DNA分子中兩條鏈的反向平行關系可判斷，②鏈從L到R的方向為5,-3',

A錯誤；PCR過程是通過高溫將雙鏈DNA之間的氫鍵斷開，并且是全部解旋之后才進行復

制，B錯誤；以1個DNA為模板經3次循環產生的DNA分子數目為23=8,需消耗7個引

物③，C錯誤。

2.（2024?重慶高三質檢）不對稱PCR是利用不等量的一對引物來產生大量單鏈DNA（ssDNA）

的方法，如圖所示。不對稱PCR中加入的一對引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較

多的被稱為非限制性引物，兩者的比例通常為1：100,PCR反應最初的若干次循環中，其擴

增產物主要是雙鏈DNA（dsDNA）,但當限制性引物消耗完后，就會產生大量的ssDNA。下列

相關說法錯誤的是（）

也”限制性引物

乙

3'5'、

\\R--非限制性引物

x乙j?ii1111h

3，5，

A.用不對稱PCR方法擴增目的基因時，不需要知道基因的全部序列

B.進行最初若干次循環的目的是增加模板DNA的量

C.最后大量獲得的ssDNA與圖中乙鏈的堿基序列一致

D.因為雙鏈DNA和單鏈DNA的分子量大小不同，可通過電泳方法將其分離

答案C

解析不對稱PCR中加入的一對引物中含量較多的被稱為非限制性引物，非限制性引物是與

乙鏈結合，最后大量獲得的ssDNA與圖中甲鏈的堿基序列一致，C錯誤。

3.（2024?無錫高三模擬）重疊延伸PCR可實現定點基因誘變，其操作過程如圖所示（凸起處代

表突變位點）。下列說法正確的是（）

通用引物FP1突變引物FP2

突變引物通用引物RP2

①3RP1I

——第1對引物

的PCR產物

第對引物

2重疊區域

的PCR產物

②卜昆合、變性、復性

―能------

L通用引物RP2

PCRI?

茨―

突變的基因

A.過程①需要把兩對引物同時加入一個擴增體系以提高擴增效率

B.過程①需要2輪PCR才能得到圖中所示PCR產物

C.過程②的產物都可以完成延伸過程

D.若過程④得到16個突變基因則需要消耗15個通用引物RP2

答案D

解析兩種突變引物能互補配對，因此過程①必須分兩個反應系統進行，A錯誤；過程①至

少需要3輪PCR才能得到圖中所示PCR產物，B錯誤；過程②獲得的產物不都可以完成延

伸過程，因為子鏈只能從引物的3'端開始延伸，C錯誤；若過程④得到16個突變基因，由

于模板中不含有通用引物，則產生16個突變基因共需要消耗16X2—2=30（個）通用引物，而

需要通用引物RP2的數量為30+2=15（個），D正確。

4.反向PCR是一種通過已知序列設計引物對未知序列（圖中L、R）進行擴增的技術，其過程

如圖所示。下列相關敘述不正確的是（）

環化并加入根據已

知序列合成的引物

③PCR擴增

L

已知序列已知序列

A.過程①用同一種限制酶對未知序列兩端進行切割

B.過程②需要使用DNA連接酶，形成磷酸二酯鍵

C.過程③PCR體系需要添加耐高溫的DNA聚合酶和解旋酶

D.該技術可檢測T-DNA整合到植物染色體DNA的位置

答案C

解析過程③即PCR擴增，PCR技術中DNA解旋是在高溫下實現的，不需要加入解旋酶，

C錯誤。

5.IKK激酶參與動物體內免疫細胞的分化。臨床上發現某重癥聯合免疫缺陷（SCID）患兒的

/K曲基因編碼區第1183位堿基T突變為C。為研究該患兒發病機制，研究人員應用大引物

PCR定點誘變技術獲得突變基因，如圖所示。下列說法錯誤的是（）

引物

/KK6基因"7777M-

PCR]I…T,,丁二

*5_,iiI/^Ii。

引物_LU3^

C—J—大引物a鏈

G大士物b鏈

1__/KKB基因

o___o

PCR23,I.TI5,

引物'nC-------大引物a鏈

ILG大引物b鏈

vSacI

HindTH

注：定點誘變獲得突變基因的過程，需要以下

3種引物：

引物A：S'—CCCCAACCGGAAAGTGTCA—37

、突變堿基

引物B:51—TAAGCTTCGAACATCCTA—31

一識別序列

引物C：5(—GTGAGCTCGCTGCCCCAA—3f

SacI識別序列

A.PCRi中使用的引物有引物/、引物C

B.PCR2中使用的引物有引物8、大引物b鏈

C.PCRi過程需要擴增3輪才能獲得目標產物

D.PCR2過程中，為減少錯誤DNA片段的產生可適當升高復性溫度

答案C

解析在PCRi中，需要兩種引物，將來在切取區陰基因時，在基因的左側需要用限制酶

來切割，在基因的右側用限制酶SacI切割，因此在PCRi中結合到基因右端的引物

選擇引物C,從題圖中看，另一個引物應含有突變堿基C,所以選擇引物力,A正確；在PCRj

中，有一個引物結合到了基因的左端，應含有限制酶4"dill識別的序列，所以要用到引物2,

而另外的一個引物就是大引物中的一條鏈，它應該結合到基因的右端，且從5'端到3'端的

序列中開始部位應含有SacI識別的序列，從圖中看，它是大引物的b鏈，B正確；PCRi過

程主要是為了獲得大引物，則擴增2輪即可獲得目標產物，C錯誤；由于大引物較長，含C

與G的堿基較多，為減少非目的基因的獲得，在PCR2復性過程中應適當提高溫度，便于引

物與模板鏈的結合，D正確。

6.（2024?安順高三調研）熒光定量PCR技術可定量檢測樣本中DNA含量，用于病毒檢測。其

原理是在PCR反應體系中加入引物的同時，加入與某條模板鏈互補的熒光探針。當耐高溫的

DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會水解探針，使熒光監測系統接收到熒光信號，即每擴增

一次,就有一個熒光分子生成（如圖）。通過實時檢測熒光信號強度，可得Ct值（熒光信號達到

設定閾值時所經歷的循環次數）。下列相關敘述錯誤的是（）

A.PCR每個循環包括變性、復性（引物和模板結合）、延伸3個階段

B.耐高溫的DNA聚合酶在該反應中的作用是形成磷酸二酯鍵

C.最終監測的熒光強度與起始時反應管內樣本DNA的含量呈正相關

D.Ct值越大表示被檢測樣本中病毒數目越多，患者危險性更高

答案D

解析Ct值越小，說明所需循環的次數越少，被檢測樣本中病毒數目越多，D錯誤。

7.（2024?襄陽高三模擬）通過設計引物，運用PCR技術可以實現目的基因的定點誘變。如圖

為基因工程中獲取突變基因的過程，其中引物1序列中含有一個堿基T不能與目的基因片段

配對，但不影響引物與模板鏈的整體配對，反應體系中引物1和引物2的5'端分別設計增

加限制酶a和限制酶b的識別位點。下列有關敘述不正確的是（）

酶aT

引物］三____________

7二7引物2

酶第沖CRBb

引物------------

一.------------^引物2

酶a箸輪酶b

引物1士二一二二物2

Ai酶b

I

A.引物中設計兩種限制酶識別位點有利于目的基因定向插入

B.復性溫度過高會導致引物不能與模板牢固結合，PCR擴增效率下降

C.第3輪PCR,引物1能與圖中②結合并且形成兩條鏈等長的突變基因

D.第3輪PCR結束后，含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA占1/2

答案D

解析引物中設計兩種限制酶識別位點，可以配合載體的限制酶識別位點，幫助目的基因定

向插入載體，避免發生自身連接，A正確；PCR技術中，復性溫度過高會導致引物不能與互

補DNA鏈（模板）牢固結合，PCR擴增效率下降，B正確；第3輪PCR結束后，含突變堿基

對且兩條鏈等長的DNA有1個，而子代DNA有23=8（個），故含突變堿基對且兩條鏈等長

的DNA占1/8,D錯誤。

8.（2024?南通高三調研）如圖是被農桿菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者將其連接成環，

并以此環為模板進行PCR,擴增出T—DNA插入位置兩側的未知序列，據此來確定T—DNA

插入的具體位置。下列有關說法錯誤的是（）

未知序列引物①T-pNA引物②未知序列

I：J匚/二J

限制st切點引物③引物④限制儲切點

A.農桿菌在自然條件下主要侵染雙子葉植物和裸子植物，T—DNA存在于其Ti質粒上

B.利用圖中的引物②③組合可擴增出兩側的未知序列

C.若擴增循環〃次，需要2"+i—2個引物

D.將擴增出的未知序列與水稻基因組序列比對可確定T—DNA的插入位置

答案B

解析農桿菌在自然條件下主要侵染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染

能力，A正確；耐高溫的DNA聚合酶可在引物的3'端延伸子鏈，因此利用圖中的引物①④

組合可擴增出兩側的未知序列，B錯誤；擴增循環〃次，得到2"個DNA分子，總單鏈數為

2X2"即2—1條，只有最初的2條母鏈不需要引物，因此共需要2/1一2個引物，C正確；不

同的DNA分子或DNA區段具有特異性，將擴增出的未知序列與水稻基因組序列比對可確定

T—DNA的插入位置，D正確。

9.實時熒光定量RT—PCR技術需要在常規PCR基礎上添加熒光染料或熒光探針，熒光染料

能特異性摻入DNA雙鏈中，從而發出熒光信號。在流感流行季節，對懷疑流感病毒感染的

患者，可以通過實時熒光定量RT—PCR技術進行核酸檢測。下列相關敘述不正確的是（）

針

1.熱變性魯譬熒光物質點謁淬滅物質

IIIIIIIIIIIIIIIIIIII

2.復性/探針與模板的雜交

聚合也?探針雜交。

r~rQf.................

??????????????

3.延伸反應TTT

A.圖中的探針可能是利用熒光分子標記的流感病毒獨特的基因序列

B.核酸檢測是通過檢測熒光信號來確定樣本中是否有病毒核酸的

C.PCR技術利用了DNA雙鏈復制的原理，需要解旋酶和耐高溫的DNA聚合酶的催化

D.用熒光RT—PCR技術測定病毒的核酸具有特異性

答案C

解析PCR技術利用了DNA雙鏈復制的原理，不需要解旋酶，可通過高溫使DNA雙鏈解開,

但需要耐高溫的DNA聚合酶的催化，C錯誤。

二、非選擇題

10.(2023?江蘇，22節選)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達，運用重組酶技術

構建質粒，如圖1所示。請回答下列問題：

擬構建的720bp390bp

注：EGFP熒光蛋白

基因結構EGFP

AnBl納米抗體。

Fg2gF2片段PCR引物

叱FF1片段-及目的產

、一堂包物片段

T7坳F2-R

Fi-RE>一線性質粒

基因重組AmPR)-------------------

載體

克隆流程PCR產物片段與重組酶

線性載體混合J里一

注：一?表示PCR引物;

相同背景方框表示

同源序列。

圖1

(1)分別進行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應體系中不同的有,

擴增程序中最主要的不同是。

(2)將PCR產物片段與線性質粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環化質粒，直接用于轉

化細菌。這一過程與傳統重組質粒構建過程相比，無需使用的酶主要有。

(3)轉化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養基篩選，下列敘述錯誤的有。

A.稀釋涂布平板需控制每個平板30~300個菌落

B.抗性平板上未長出菌落的原因一般是培養基溫度太高

C.抗性平板上常常會出現大量雜菌形成的菌落

D.抗性平板上長出的單菌落無需進一步劃線純化

(4)為了驗證平板上菌落中的質粒是否符合設計，用不同菌落的質粒為模板、用引物Fl—F和

F2—R進行了PCR擴增，質粒P1?P4的擴增產物電泳結果如圖2。根據圖中結果判斷，可

以舍棄的質粒有=

圖2

⑸對于PCR產物電泳結果符合預期的質粒，通常需進一步通過基因測序確認，原因是

答案⑴模板、引物引物的設計（2）限制酶、（T4）DNA連接酶（3）ABC（4）P3、P4（5）

電泳只能檢測DNA分子的大?。ㄩL度），無法確定待檢測DNA分子的堿基序列

解析（l）PCR反應進行的條件：引物、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。分別進

行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應體系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、

引物。PCR過程需要兩種引物，能分別與目的基因兩條鏈的3'端通過堿基互補配對結合。

引物設計是決定PCR反應成敗的最主要因素。（2）傳統重組質粒構建需要使用限制性內切核

酸酶（限制酶）切割質粒，使其具有與目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA連接酶將目的

基因和質粒連接成重組質粒。將PCR產物片段與線性質粒載體混合后，在DNA連接酶的作

用下可形成環化質粒，不需要使用限制性內切核酸酶（限制酶）。（3）用稀釋涂布平板法培養計

數時，為了使結果更準確，一般選擇菌落數為30?300的平板，A錯誤；培養基冷卻后才接

種，故抗性平板上未長出菌落不是因為培養基溫度太高，B錯誤；轉化后的大腸桿菌需采用

含有抗生素的培養基篩選，一般含有重組質粒的大腸桿菌才能發展為菌落，故不會出現大量

雜菌形成的菌落，C錯誤；稀釋涂布平板法和平板劃線法均為分離純化細菌的方法，用稀釋

涂布平板法接種后在抗性平板上長出的單菌落無需進一步劃線純化，D正確。（4）EGFP為720

bp,AnBl為390bp，二者的總大小為720+390=1100（bp）,用引物Fl-F和F2-R進行PCR

擴增，其大小接近于Pl、P2,根據圖中結果判斷，可以舍棄的質粒有P3、P4o（5）瓊脂糖凝

膠電泳技術僅能用于分析待檢測DNA分子的大小，無法確定待檢測DNA分子的堿基序列，

因此對于PCR產物電泳結果符合預期的質粒，通常需進一步通過基因測序確認。

11.基因工程在農業方面的應用發展迅速，我國轉基因作物的種植面積在世界有較高排名。

請回答下列相關問題：

（1）目的基因的篩選與獲取是基因工程的第一步。為提高機會和可能，目的基因往往從相關的

_______________________的基因中進行篩選。

⑵目的基因可以人工合成、從基因文庫中獲取，還可以利用PCR技術獲取和擴增。如圖1

展示了PCR技術獲取和擴增目的基因的原理，請分析回答下列問題：

目的基因

圖1

①PCR技術利用了DNA半保留復制原理和原理。PCR的一次循環包括變性、

復性和延伸三個過程，復性的作用是。

②將一個DNA分子進行擴增，理論上目的基因最早在第次循環后獲得；第5次循環

后，可擴增得到個目的基因。

（3）反向PCR可用于擴增未知序列，其原理如圖所示。圖中鏈狀DNA分子內側是已知序列,

外側為未知序列。請回答相關問題：

圖3經EcoR酶切后的DNA分子圖4環化后的DNA分子

①EcoRI酶切后得到的一AATT稱為黏性末端，“黏性”的含義是,EcoRI

切割得到黏性末端的原因是_________________________________________________________

②不直接在圖2中DNA分子的兩端設計引物并進行擴增,原因是0

③圖4中環狀DNA進行PCR的過程中，沿引物A延伸子鏈的延伸方向是（填“順時

針”或“逆時針”），PCR產物（填“含有”或“