艸艸艸艸艸艸艸艸生物技術進展生物技術進展2023年第13卷第6期934~939CurrentBiotechnologyISSN2095?2341艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸艸pH漸變條件下多酶分步連續酶解工藝制備鱘魚硫酸軟骨素與膠原蛋白肽王珍瑜1，陸文超1，鐘康榮2，關永健2，汪真2，陳超1*1.清華大學化學系，北京100084；2.貴州千鱘生物科技有限公司，貴州黔東南苗族侗族自治州556300摘要：pH漸變條件下采用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶分步連續酶解鱘魚軟骨，同時制備鱘魚硫酸軟骨素和膠原蛋白肽。分別通過溫度、酶解時間、酶用量3個單因素實驗，研究其對連續酶解效果的影響。綜合分析得出最佳條酶用量為50U·g-1底物；菠蘿蛋白酶的酶解溫度為50℃,酶解時間為2h，酶用量為30U·g-1底物。該工藝條件下制備的鱘魚硫酸軟骨素提取率為85%，純度93%，膠原蛋白肽的提取率為82%，純度為90%。研究建立的pH漸變條件下多酶分步連續酶解工藝，產率與純度較國內現有生產方法均有提高，且堿液使用量減少，避免了有機溶劑的引入，從而可以降低生產成本，減輕環境污染負擔。中圖分類號：Q556，TQ925+.2文獻標byMulti-enzymeStep-by-stepEnzymaticHydrolysisUndertheConditionofpHGradientWANGZhenyu1，LUWenchao1，ZHONGKangrong2，GUANYongjian2，WANGZhen2，CHENChao1*dosagewas100U·g-1andenzymedosagewas30U·g-1基金項目：清華大學國強研究院項目。 王珍瑜，等：pH漸變條件下多酶分步連續酶解工藝制備鱘魚硫酸軟骨素與膠原蛋白肽935鱘魚，又名鱘龍，隸屬于硬骨魚綱輻鰭亞綱硬鱗總目鱘形目，是地球上最原始和最古老的軟骨魚種之一，也是淡水魚中壽命最長、個體最大的魚類［1］。近年來，我國開展了鱘魚養殖，目前，我國已成為世界鱘魚養殖第一大國，其中史氏鱘頭、脊索、鰭中軟骨占魚體質量的10％左右。軟骨中含有豐富的硫酸軟骨素和膠原蛋白，具有很高的營養價值和較強的保健功能，素有“鯊魚性粘多糖，結構復雜，主要以與蛋白質結合的蛋白聚糖形式存在［4-5］。硫酸軟骨素作為一種天然的活性成分在醫藥領域有著廣泛的應用前景［6-7探索并開發硫酸軟骨素具有重要的經濟與社會價值［8-10］。波法、乙酸抽提法和酶解法等［11-12］。常用的硫酸軟骨素提取方法一般需要使用大量的堿液和有機溶劑，提取率相對也比較低。Ⅱ型膠原蛋白是鱘魚軟骨中的主要蛋白，其由3個分子量約為110kD的α鏈組成。鱘魚軟骨中的膠原蛋白也具有一定的營養價值，但由于其分子量太大且具有三螺旋結構，不易被快速消化吸收，其功效與價值很難被化吸收率會得到明顯提高［13］。近年來，研究者也加大了對膠原蛋白肽的提取、分離、純化工藝的研究［14-16進而對其生理作用進行探究［17-18］。本研究在pH漸變條件下用多酶連續分步酶解工藝，采用單因素試驗法考察了酶用量、酶解時間、酶解溫度3個因素對酶解效果的影響。酶解后利用超濾分離即可得到純度較高的硫酸軟骨素和膠原蛋白肽，期望為今后用鱘魚軟骨生產硫酸軟骨素和膠原蛋白肽提供了工藝依據。1材料與方法供；木瓜蛋白酶240U·mg-1、堿性蛋白酶100U·mg-1、菠蘿蛋白酶100U·mg-1均購自南寧東恒華道生物科技有限責任公司；硫酸軟骨素標準品購自上海阿拉丁生化科技有限公司；鹽酸氨基葡萄糖對照品購自Sigma公司；對二甲氨基苯甲醛、乙酰丙島津LC-16液相色譜儀；PL203型電子天平（梅特勒-托利儀器（上海）有限公司島津UV-2600i紫外分光光度計；TYM-8電熱恒溫水浴鍋（中國濟南天宇專用設備有限公司高速粉碎機（TP-1000C-8，寧波新芝生物科技股份有限公司臺式高速冷凍離心機（TGL-16M，長沙易達儀器有限公司真空冷凍干燥機（FD-5，上海能共實業有限公司）。骨上殘留的肌肉、脂肪和其他結締組織，用絞碎，放入水中攪拌，然后過篩清洗，以除1.2.2酶解法提取硫酸軟骨素與膠原蛋白肽鱘魚軟骨稱重，加軟骨5倍重量的去離子水，用膠體至25℃,加碳酸鈉調pH至8.5。先加入堿性蛋白酶，控溫酶解一段時間（按單因素實驗梯度設置進單因素實驗梯度設置進行然后加入菠蘿蛋白酶，控溫酶解一段時間（按單因素實驗梯度設置進的中空纖維膜超濾，截留部分冷凍干燥后得到鱘魚硫酸軟骨素，透過液冷凍干燥后得到膠原蛋白式中，Y為提取率，C1為產物中目標物的含為原料質量。1.2.3單因素實驗實驗條件和梯度范圍對酶解溫度、酶解時間和酶用量分別進行單因素實驗，堿55、60℃);堿性蛋白酶酶解時間選取6個水平·g-1木瓜蛋白酶936生物技術進展CurrentBiotechnology93670、80U·g-1菠蘿蛋白酶酶解溫度選取6個水平);菠蘿蛋白酶酶解時間·g-11.2.4硫酸軟骨素含量檢測硫酸軟骨素含量參照GB/T20365-2006硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖含量的測定方法并采用液相色譜法進行含量測定。色譜柱：C18（250mm×4.6nm，5μm流動等度洗脫，流速0.8mL·min-1，檢測波長為192nm，柱溫為30℃,進樣量為10μL。1.2.5膠原蛋白肽含量檢測膠原蛋白肽含量檢測參照GB/T5009.5-2003中的方法測定。蛋白質的換算系數為6.25。稱取充分混勻的固體試樣0.2~2.0g（約當于30~40mg氮精確至0.001g，至消化管中，再加入0.4g硫酸銅、6g硫酸鉀及20mL硫酸于消化爐進行消化。當消化爐溫度達到420℃之后，繼續消化1h，此時消化管中的液體呈綠色透明狀，取出冷卻后加入50mL水，于自動凱氏定氮儀（使用前加入氫氧化鈉溶液，鹽酸或硫酸標準溶液以及含有混合指示劑A或B的硼酸溶液）上實現自動1.2.6蛋白分子量范圍檢測蛋白分子量范圍檢測按GB31645-2018附錄A方法檢測。色譜柱：TSKgelG2000SWXL（300mm×7.8nm流動相：乙度洗脫，流速0.5mL·min-1，檢測波長為1220nm，柱溫為30℃,進樣量為10μL。2結果與分析2.1堿性蛋白酶酶解條件的單因素實驗分析2.1.1酶解溫度對酶解效果的影響在堿性蛋白酶用量為200U·g-1底物，酶解時間為6h，以酶解后的蛋白分子量范圍為指標，考察酶解溫度對酶解效果的影響，結果如圖1所示。升高溫度有利于酶解，當溫度為45℃時酶解效果最好，溫度繼續增加對酶解效果的改善有限，因此，綜合考慮選取酶解溫度45℃進行優化試驗。2.1.2酶解時間對酶解效果的影響在堿性蛋白酶用量為200U·g-1底物，酶解溫度為45℃,以酶解后的蛋白分子量范圍為指標，考察酶解時間對酶解效果的影響，結果如圖2所示。當酶解時間超分子量小于10000Da蛋白占比/%圖1酶解溫度對堿性蛋白酶酶解效果的影響圖2酶解時間對堿性蛋白酶酶解效果的影響2.1.3酶用量對酶解效果的影響在酶解溫度為45℃,酶解時間為2h，以酶解后的蛋白分子量分布為指標，考察堿性蛋白酶用量對酶解效果的影響，其結果如圖3所示。酶用量在100U·g-1以下時，隨著酶用量的增大，酶解效果逐漸提高，之后分子量小于10000Da蛋白占比/%4005010015酶用量/(U·g)圖3酶用量對堿性蛋白酶酶解效果的影響 王珍瑜，等：pH漸變條件下多酶分步連續酶解工藝制備鱘魚硫酸軟骨素與膠原蛋白肽937再增大酶用量對酶解效果影響很小。綜合考慮，選擇酶用量為100U·g-1作為最佳酶用量條件。2.2木瓜蛋白酶酶解條件的單因素實驗分析以堿性蛋白酶酶解后（酶用量100U·g-1底物，通過改變酶解溫度、酶解時間和酶用量3個單因素來研究木瓜蛋白酶酶解條件對酶解效果的影響。2.2.1酶解溫度對酶解效果的影響在木瓜蛋白酶用量為50U·g-1底物，酶解時間為6h，以酶解后的蛋白分子量分布為指標，考察酶解溫度對酶解效果的影響，其結果如圖4所示。隨著溫度的增加，酶解效率呈先增大后減小的趨勢，當溫度達到進行優化實驗。分子量小于10000Da蛋白占比/%圖4酶解溫度對木瓜蛋白酶酶解效果的影響2.2.2酶解時間對酶解效果的影響在木瓜蛋白酶用量為50U·g-1底物，酶解溫度為50℃,以酶解后的蛋白分子量分布為指標，考察酶解時間對酶解效果的影響，其結果如圖5所示。當酶解時間為2h比達到79%，隨著時間的增加，結果在79%上下浮2.2.3酶用量對酶解效果的影響在酶解溫度為50℃,酶解時間為2h，以酶解后的蛋白分子量分布為指標，考察木瓜蛋白酶用量對酶解效果的影響，結果如圖6所示。當酶用量達到50U·g-1，再增加酶的用量對酶解效果的提高很小，因此選擇酶用量為50U·g-1作為最佳酶用量條件。分子量小于10000Da蛋白占比/%858580757065602030405060708090酶用量/(U·g)圖6酶用量對木瓜蛋白酶酶解效果的影響2.3菠蘿蛋白酶酶解條件對酶解效果的影響以堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解后（堿性蛋白酶用量100U·g-1底物，酶解時間2h，酶解溫度45℃;木瓜蛋白酶用量50U·g-1底物，酶解時間2h，酶解溫度50℃)的液體為原料，分別通過改變酶解溫度、酶解時間和酶用量3個單因素來研究菠蘿蛋白酶酶解條件對酶解效果的影響。2.3.1酶解溫度對酶解效果的影響在菠蘿蛋白酶用量為30U·g-1底物，酶解時間為6h，以酶解后的蛋白分子量分布為指標，考察酶解溫度對酶解效果的影響，其結果如圖7所示。隨著溫度的增加，酶解效率呈先增大后減小的趨勢，當溫度達到8585807570656001234567時間/h圖5酶解時間對木瓜蛋白酶酶解效果的影響分子量小于10000Da蛋白占比/%圖7酶解溫度對菠蘿蛋白酶酶解效果的影響938生物技術進展CurrentBiotechnology9382.3.2酶解時間對酶解效果的影響在菠蘿蛋白酶用量為30U·g-1底物，酶解溫度為50℃,以酶解后的蛋白分子量分布為指標，考察酶解時間對酶解效果的影響，結果如圖8所示。隨著酶解時間的延長，酶解效果總體上呈升高的趨勢，考慮到2h與6h時的效果僅相差2%，綜合考慮后選擇酶解時間為2h進行優化實驗。分子量小于10000Da蛋白占比/%90908886848280時間/h圖8酶解時間對菠蘿蛋白酶酶解效果的影響2.3.3酶用量對酶解效果的影響在酶解溫度為50℃,酶解時間為2h，以酶解后的蛋白分子量分布為指標，考察菠蘿蛋白酶用量對酶解效果的影響，結果如圖9所示。當酶用量為30U·g-1時，酶解效果最好，分子量小于10000Da的蛋白占比達到89%，隨著酶用量的增加，酶解效果變化不明顯，因此，選擇酶用量以30U·g-1作為最佳條件。分子量小于10000Da蛋白占比/%酶用量/(U·g)圖9酶用量對菠蘿蛋白酶酶解效果的影響綜合考慮單因素實驗得到的最佳工藝參數及操作的可行性，確定連續分步酶解工藝制備硫酸軟骨素與膠原蛋白肽的最佳工藝參數為：堿性蛋白酶用量為100U·g-1底物，酶解溫度45℃,酶解時間2h；木瓜蛋白酶用量為50U·g-1底物，酶解溫度50℃,酶解時間2h；菠蘿蛋白酶用量為30U·g-1底物，酶解溫度50℃,酶解時間2h。最佳條件下制備的鱘魚硫酸軟骨素的提取率為85%，純度93%，膠原蛋白肽的提取率為82%，純度為90%。3討論本研究以養殖鱘魚軟骨為原料，用pH漸變條件下多酶連續分步酶解工藝，可實現同時制備高純度的鱘魚硫酸軟骨素與膠原蛋白肽。最佳條件下制備的鱘魚硫酸軟骨素的提取率為85%，純度93%，膠原蛋白肽的提取率為82%，純度為90%。鱘魚軟骨中含有豐富的硫酸軟骨素和膠原蛋白，具有很高的應用價值。傳統方法提取硫酸軟骨素一般需采用大量的堿液和有機溶劑，提取率相對較低。因此，對現有方法進行改良十分必要。周暢等［19］利用響應面方法優化鰩魚硫酸軟骨素提純工藝，結果表明，最優提取工藝為堿液濃度骨素提取率為43.32%。與之相比，本文制備的鱘魚硫酸軟骨素的提取率為85%，純度93%，本工藝大大提高了硫酸軟骨素的提取率。胡藝等［20］通過酸溶-胃蛋白酶從鱘魚軟骨中提取的膠原蛋白，相對于加入NaOH浸泡去除非膠原成分、滅酶活以及加入冰醋酸透析，本文則減少了堿液使用量、且不需要有機溶劑的參與。綜上，本試驗為鱘魚養殖及其副產物的加工提供了一條新的路徑，與現有生產工藝相比，操作簡單，減少了堿液使用量且不需要有機溶劑