34RegulationfordetectionofextraintestinalpathogenicEscherichiacolifromswineI本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定1豬腸外致病性大腸桿菌分離鑒定規程GB4789.6食品安全國家標準食品微生物學檢驗致瀉大腸埃希氏GB4789.38食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸埃希氏GB4789.41食品安全國家標準食品微生物學檢驗腸桿菌SN/T2025動物檢疫實驗室生SN/T2984檢驗檢疫動物病原微生物實驗活動生物3.1腸外致病性大腸桿菌extraintestinalpatho4主要設備和材料4,1顯微鏡：10×~100×。4,4冰箱：0℃~4℃。4,6無菌試管：12mm×100mm，15mm×150mm。4.7麥氏比濁管。2）：5操作規程5.2操作步驟5.2.1樣品采集采集：無菌操作采集病豬的肝臟、肺臟、脾臟、淋巴結、腦等腸外組織，或關節積液、心包保存與運輸：病料樣品采集后不能及時鹽水溶液中，保存時間不超過72h。樣品均需采取低溫（0℃~4℃)保存和運輸。5.2.2細菌分離與純化落呈鮮桃紅色或粉紅色，中等大小，直徑1.0mm～2.5mm，圓形，邊緣整齊，表面光滑）再5.2.3腸外大腸桿菌鑒定形態特征鑒定：革蘭氏染色鏡檢。大腸桿菌為革蘭氏陰性直短桿菌，兩端鈍圓，無芽孢，多生化特性鑒定：先取純化菌落接種三糖鐵（TSI）瓊脂斜面糖蛋白胨水、枸櫞酸鹽培養基，37℃培養18h～24h，進行吲5.2.4腸外大腸桿菌致病性鑒定并將死亡的小鼠在無菌操作下取其肺臟、肝臟、脾臟組織分別接種于MAC，37℃培養24h，挑取大腸35.2.6腸外致病性大腸桿菌系統進化群鑒定4A.1飽和氯化鈉溶液A.1.1成分A.1.2制法將38.0g～39.0g氯化鈉加入100mL蒸餾水中，充分攪拌，待完全溶解混勻后，分裝于采樣A.230％甘油緩沖鹽水溶液A.2.1成分A.2.2制法A.3.1成分A.3.2制法5↓（菌落呈鮮紅色或粉紅色，中等大小，直徑1.0mm～2.5m↓↓（TSI：斜面和底面均變黃或變紅，產氣，不產H2S。↓↓↓6取O抗原分別與大腸桿菌的O抗原單因子血清進行玻片凝集反應。即O抗原和O抗原單因子血清各取混合物作對照，觀察有無自凝集現象。玻片凝集試驗判定標+-a)O抗原單因子定型血清的稀釋：采取倍0.5mL加入第1管，在管內反復吹打6～8清稀釋倍數分別是1:20，1:40，1:80b)加入抗原：向各支試管中分別加入0.5mLO抗原，此時血清稀釋倍數相應增大一倍；3)凝集強弱判斷（以“＋”表示確定抗體凝集效價時，應以出現“++?（50凝集現象?“++++?液體完全透明，100％凝集，管底出現大片的?“+++?液體幾乎透明，75％凝集，管底有明顯的傘狀沉淀，震蕩時呈小或大絮片狀；7?“++?液體中等混濁，50％凝集，管底有中等量的傘狀沉淀，震蕩時呈小絮片狀；?“+?液體透明度不明顯，25％凝集，管底有少許不明顯的傘狀沉淀；?“-?抗原抗體不凝集，液體混濁、無透明度，管底無傘狀沉淀，但由于菌體自然下沉，管82×PCRMasterMix、超純水、瓊脂糖、10mg/ML溴化乙錠（EB）、TBE緩（10×LoadingBuffer）、相對分子質量Mar豬腸外致病性大腸桿菌系統進化群PCR鑒定用引物yjaAyjaA-FyjaA-RTspE4.C2-FD.2.2ExPEC的系統進化群分9V，電流10