1驢用乳酸菌制劑生產技術規程本文件規定了乳酸菌相關的定義和術語、生產技術流程、發酵環境和設備要求、產品質量檢測和保藏運輸。本文件適用于驢用乳酸菌制劑的制備生產。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB20287農用微生物菌劑GB3095環境空氣質量標準GB/T19525.2畜禽場環境質量評價準則GB5749生活飲用水衛生標準GB13078飼料衛生標準NY/T5027無公害食品畜禽飲用水水質3定義和術語下列定義和術語適用于本標準。3.1乳酸菌（lacticacidbacteria，LAB）能夠利用且可發酵碳水化合物并產生大量乳酸的一類能被革蘭氏染色成紫色（陽性）的細菌的統稱，在毛驢養殖中可作為飼料添加劑和養殖場除臭劑。注：本標準中涉及的乳酸菌主要包括馬屬動物源的戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、植物乳桿菌(L屎腸球菌(Enterococcusfaecium)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)。3.2甘油菌theGlycerinstrain由馬屬動物（馬和驢）腸道內容物分離純化并鑒定的單菌落，添加15%~20%的甘油，在-80℃保存的菌種。23.3一代菌種first-generationofstrain甘油菌接種至液體培養基玻璃三角瓶中活化，37℃12h培養的菌種。3.4二代菌種Second-generationofstrain玻璃三角瓶中的一代菌種接種至發酵罐中，在發酵罐中37℃富集培養12h的菌種。4發酵設備和環境4.1發酵設備發酵設備為不銹鋼全自動液體或固態發酵罐，根據生產規模選擇發酵罐體積。4.2環境4.2.1發酵生產車間空氣質量要符合GB3095中Ⅱ類標準要求。4.2.2發酵用水應符合GB3838-2002標準中Ⅲ類地表水質要求，其他用水應符合該標準中Ⅳ類水質要4.2.3發酵車間要完善消毒滅菌設備，各個操作間或發酵車間應獨立且聯通部都設有除菌設施。4.3消毒實現每日或定時消毒。工作人員下班后，進行徹底消毒。5發酵工藝流程5.1發酵工藝流程見附錄A。5.2培養基5.2.1復蘇培養基應保證甘油菌和一代菌種能夠快速復蘇、促進生長、營養豐富。5.2.2生長培養基應保證二代菌種大量富集生長的條件下，應與發酵培養基相近。5.2.3發酵培養基應保證促進生長、來源廣泛、價格低廉、制備簡便等特征。5.3菌種物種及純度鑒定5.3.1用于發酵生產的菌株應通過了生理生化及分子鑒定，具有完善的菌株來源及安全性報告等相關信5.3.2在發酵前應采用稀釋平板法檢測一代和二代菌株的純度及生長性能，如不合格，及時純化復壯。35.3.3發酵生產前,需檢測種子罐中菌體的濃度，濃度達到大于或等于108CFU/mL以上，pH值小于4.0。5.4滅菌5.4.1復蘇培養基和生長培養基采用全自動高壓鍋滅菌，條件為121℃,30min，0.1MPa～0.15MPa，自然冷卻后進行培養。5.4.2發酵罐的裝液量小于總體積的2/3，干粉培養基溶解后導入發酵罐中。液體發酵前，將發酵罐設備采用高壓蒸汽進行徹底滅菌，條件為120℃~125℃,0.1MPa～0.15MPa，30min～40min,自然冷卻后進行發酵。5.4.3固態發酵前，物料起始含水量控制在45%～55%，采用高壓蒸汽進行徹底滅菌，條件為120℃~125℃,0.1MPa～0.15MPa，1.0h～3.0h。5.5接種甘油菌到一代菌種接種量為0.1%～0.5%，二代種子到發酵罐接種量為10%～20%。所有步驟均在無菌環境下操作，厭氧或微好氧培養。5.6發酵5.6.1乳酸菌的培養溫度應控制在32℃~37℃。5.6.2應在厭氧條件或微好氧條件發酵，液體可處于靜置發酵，固態發酵攪拌轉數100r/min～150r/min。5.6.3當有效活菌數大于或等于108CFU/mL以上，且pH小于4.0，結束發酵。5.6.4發酵生長周期為36h～48h。5.7保藏5.7.1液體培養物進行差速離心，濃縮菌液（105m3/h），按照1:1比例加入保護劑混合，采用大型凍干機凍干后，4℃保藏。活菌數檢測見附錄B。保護劑配方見附錄C。凍干條件見附錄D。5.7.2固態菌劑經干燥后無菌密封包裝，4℃保藏。6產品質量檢測相關產品質量檢測包括水分、pH、有效活菌數和污染率等指標，檢驗合格才能出廠。所有指標均按照按GB20287執行。7儲存及運輸7.1貯存在通風、干燥、潔凈的倉庫。7.2運輸時，防止極端環境影響，避免受壓或損傷，運輸工具保持清潔。（資料性）乳酸菌生產技術流程圖5菌數檢測B.1濃縮前活吸取1ml菌液，準確加入38℃~40℃無菌生理鹽水9ml，振蕩使其充分分散，倍比稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-8，4個稀釋度，每個稀釋度設3個重復。取10-7，100ul涂板，培養，菌落計數。B.2凍干后菌數檢測完全凍干后收集干粉稱重，稱取5g樣品，準確加入38℃~40℃無菌生理鹽水10mL，振蕩使其充分分散，倍比稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-8，4個稀釋度，每個稀釋度設3個重復。10-8取100ul涂板，培養，菌落計數。凍干劑配方表C.1凍干劑配方物料名稱百分比脫脂乳5%（1mL純化水放0.05g）蔗糖9%（1mL純化水放0.09g）凍干條件表D.1凍干條件產品類別參數預凍時間（分）溫度(℃)-36冷阱