基因治療

基因治療基因治療一、基因治療的概念●基因治療:指用(正常或野生型)基因導入人體的細胞，使其發揮生物學效應，從而達到治療疾病目的的技術方法。●基因療法-----在于后者的目的基因不與宿主細胞內的基因發生整合。基因治療與基因療法的區別

基因治療基因治療的類型生殖細胞基因治療體細胞基因治療基因治療

目的基因的選擇與制備受體細胞的培養載體的選擇將目的基因導入靶細胞(導入方法的選擇)

轉導細胞的篩選和鑒定基因治療的安全性監測和療效評價基因治療的基本程序

基因治療二、基因治療的基本程序

(一)目的基因的制備(方法)基因的克隆化基因的人工合成基因的PCR擴增人體基因組的降解

使用的目的基因的種類：染色體基因組、cDNA基因治療(二)基因導入方式(方法)的選擇按導入方式的不同，外源基因導入人體內的方法可分為3類：1.直接法(體內法)(invivo)

特點：直接向體內某組織(器官)轉基因。

優點：操作簡便；缺點：基因轉移和表達的效率都較低。2.間接法(回輸法)(exvivo)或稱離體法特點：離體培養細胞，轉基因后回輸至患者體內。優點：成功率相對較高；缺點：操作繁瑣。目前此類方法常用。3.原位法(insitu)直接向患者的病變部位轉基因。基因治療(三)基因導入的病毒學方法●目標基因導入靶細胞的方法分為兩類：病毒學方法和非病毒學方法●病毒學方法(病毒介導的基因轉移方法)

是指以重組病毒為載體，通過感染將目的基因導入靶細胞的方法。●常見的RNA病毒載體：逆轉錄病毒(retrovirus,RV)

慢病毒(lentivirus):也屬于RV家族腺病毒(adenovirus,Ad)基因治療1.逆轉錄病毒載體▼逆轉錄病毒的基因組結構及生活周期▼逆轉錄病毒科是RNA病毒的一個大科(可分7個屬)。特點是具有二倍體基因，RV可將其基因組整合到感染細胞的DNA上▼基因組分為3個區：第1個區為LTR(含增強子、啟動子、轉錄起始和終止信號)第2個區為ψ序列(其編碼產物能有效包裝病毒基因組進入病毒顆粒)第3個區含3個結構基因(gag、pol、env)RV的基因組結構見下圖。基因治療逆轉錄病毒的結構特征包裝信號LTRψgagpolenvLTR調節和啟動轉錄編碼病毒核心蛋白等編碼逆轉錄酶、整合酶等編碼病毒外殼及包膜蛋白長末端重復序列基因治療如莫洛尼氏鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因組結構：

LTRLTR

ψgagpolenvU5RU3U5RU3U3=增強子，R=啟動子，U5=轉錄起始位點。Ψ=病毒包裝信號，gag=核心抗原，pol=逆轉錄酶，env=外殼蛋白。基因治療逆轉錄病毒的生活周期：基因治療逆轉錄病毒載體的構建操作要點：▼切除野生型RV的結構基因(保留包裝信號序列ψ)；▼在RV結構基因部位插入標記基因(如neo)和目的基因。基因治療逆轉錄病毒載體的構建(續)常用的是莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)構建的各類逆轉錄病毒載體長末端重復序列包裝信號LTRψ

gagpolenvLTR調節和啟動轉錄標記基因目的基因基因治療目前可供選用的逆轉錄病毒載體類型(略)基因治療如何獲得高效轉染、高安全性的重組逆轉錄病毒？弄清下列幾個概念：●逆轉錄病毒:指野生型RV●逆轉錄病毒載體:人工改造過的野生型RV●輔(助)病毒：即缺陷型逆轉錄病毒(含有完整的病毒結構基因序列，但缺失ψ及相關序列)。●包裝細胞系：經輔病毒轉染且整合了輔病毒缺陷基因的哺乳動物細胞系(包裝細胞自身不產生病毒顆粒)。●重組逆轉錄病毒：含病毒結構蛋白,但不含病毒核酸。基因治療重組逆轉錄病毒：

經包裝細胞系產生的含有病毒結構蛋白，但其RNA(由目的基因及標記基因轉錄合成)不含病毒蛋白的編碼序列，僅有一次感染能力的逆轉錄病毒顆粒。

重組逆轉錄病毒被稱為假病毒顆粒。基因治療

假病毒顆粒的產生并感染靶細胞

逆轉錄病毒載體重組逆轉錄病毒

(核酸部分只能是逆轉錄病毒載體)

LTRψ

標記基因目的基因LTR1LTRgagpolenvLTR輔病毒2Gag蛋白PoL蛋白Env蛋白包裝細胞系35LTR標記基因目的基因LTR靶細胞4包裝的病毒顆粒,其RNA系標記基因和目的基因的轉錄產物，但不含病毒蛋白的編碼序列。基因治療2、腺病毒載體(略)

(四)基因導入的非病毒學方法1、脂質體法脂質體：指人工制造的具有磷脂(脂質)雙層包膜的脂質小囊，無毒、無免疫原性。脂質體分兩類：1)普通脂質體。其作用無特異性，應用受限制。基因治療2)多態性脂質體▼

這類脂質體與核酸和細胞膜有高度反應性且不易被免疫系統識別攝取。▼目前普遍使用的陽離子脂質體lipofectin和lipofectamine(商品名)其轉染細胞的效率比一般的脂質體要高幾個數量級。▼脂質體法轉染率低、轉移的基因表達時間短暫。基因治療2、直接注射法3、受體介導的基因轉移技術4、其他方法如DNA磷酸鈣共沉淀法;電穿孔法(電脈沖介導法);顯微注射法;顆粒(微粒子)轟擊法;DEAE–Dextran法等等應該注意，逆轉錄病毒介導的基因轉移是至目前為止轉染效率最高、成功率最高、應用最廣的一種基因轉移方法。基因治療(五)靶細胞的選擇目前基因治療的靶細胞僅限于體細胞。作為基因治療的受體細胞(靶細胞)的條件：容易取出容易培養對逆轉錄病毒載體的感染比較敏感容易移植壽命較長或自新功能數量足夠基因治療常用的靶細胞的種類1.造血細胞(造血干細胞)2.皮膚成纖維細胞

3.肝細胞4.血管內皮細胞

5.淋巴細胞

6.肌肉細胞

7.腫瘤細胞

8.其他細胞基因治療(六)轉染細胞的篩選和導入基因的鑒定1、轉染細胞的篩選為何要進行篩選?(細胞形態、轉染率)利用載體上抗藥性的標記基因，如新霉素磷酸轉移酶基因(neo)進行篩選，只是篩選方法中的一種，稱為標記基因技術。此外還有基因缺陷型受體細胞的選擇基因共轉染技術分子雜交技術∴∵

基因治療新霉素抗性選擇系統

----G418篩選原理▲

新霉素是細菌抗生素,可干擾原核生物的蛋白質合成,但對真核細胞則無影響。▲

G418是新霉素的類似物，對原核和真核細胞均有毒性。▲

用具有磷酸轉移酶基因(neo)的表達載體轉染

真核細胞,若neo基因與能有效轉錄的真核DNA序列連鎖時,就能獲得有效表達,從而產生新霉素磷酸轉移酶使G418失活。顯然,當真核細胞轉入neo基因后，就會在含G418的選擇性培養基中存活，而未轉入neo基因的細胞則不能生存。基因治療2、導入基因的鑒定

直接對轉染細胞的外源基因(目的基因)的存在與否或對其表達產物的含量與活性進行鑒定。方法：PCRRT-PCRNorthern印跡免疫組化(染色)免疫印跡等等。基因治療(七)基因治療臨床試驗的審批(略)三、基因治療的主要策略和技術方法(一)基因治療的主要策略1、基因標記實驗(略)基因治療2.基因置換(基因矯正)有兩種含義:其一,指將致病基因整個地以正常基因置換，使致病基因永久性得到更正；其二，指對缺陷基因的異常序列進行精確的原位修復但不影響鄰近的基因。基因定點突變、定點敲除和定點修復均屬于基因打靶(genetargeting)技術。

目的基因靶細胞染色體

(正常基因)

同源DNA序列

(缺陷基因)

同源重組基因治療3、基因添加又稱基因增補或基因修飾：在不去除異常基因的前提下，

將目的基因導入病變細胞或其他細胞(非定點整合)，以目的基因的表達產物來補償缺陷基因的功能或使原來的功能得到加強。例如，把細胞因子(如TNF)基因導入腫瘤細胞并使其表達即屬此類。基因添加是目前基因治療應用較多的策略。基因治療4、基因干預●基因干預

是指采用特定的手段，抑制或阻斷某個基因的表達。●基因干預的靶：過度表達的癌基因、病毒復制周期的關鍵基因。●基因干預的技術方法：反義核酸技術核酶技術反義核酸-核酶技術細胞內抗體(intrabody)技術等等。基因治療(二)基因干預主要有以下幾種方法弄清以下幾個概念：反義技術(antisensetechnology)

研究和設計有效抑制靶基因表達以控制和治療疾病的人工反義分子的專門技術。

一般要滿足以下3個條件：

(1)能特異地識別靶基因的序列并與之結合；(2)在細胞內不易被酶解，存留時間較長；

(3)能透過細胞膜到達作用部位。基因治療反義核酸(antisensenucleicacid)指與細胞內DNA或RNA序列相互補形成雜交體而阻斷或減弱其轉錄和翻譯過程的DNA片段或RNA片段。目前研究較多的反義核酸有反義寡核苷酸(ODN)

反義RNA(antisenseRNA)

核酶(ribozyme)基因治療1、反義RNA技術反義RNA結合于細胞中特異mRNA的特定部位(如UTR)，可抑制有害基因的表達。反義RNA的應用方法：

(1)體外合成反義RNA，直接作用于培養細胞；(反義RNA序列設計原則？)(2)構建表達(轉錄)反義RNA的重組體，并導入細胞，轉錄出反義RNA而發揮作用。

(人工構建反義表達載體注意事項?)基因治療ODN與mRNA結合后抑制后者的翻譯(反義核酸技術)；ODN+dsDNAtsDNA(三鏈技術)反

基因ODN+dsDNA中的ssDNAdsDNA技術抑制DNA的復制與轉錄反義核酸技術的二大問題解決辦法(1)反義核酸在靶細胞中定位

受體介導轉移核酸(2)被內源性核酸酶降解

改造核苷酸的結構基因治療2、核酶(ribozyme)技術具有酶促活性的RNA稱為核酶。四膜蟲rRNA的自我剪接rRNA的剪接采用自我剪接方式基因治療最簡單的核酶二級結構——錘頭狀結構

(hammerheadstructure)

底物部分基因治療核酶催化部份和底物部份組成錘頭結構能進行分子內自我催化的RNA片段不很長，通常為60個核苷酸左右。同一分子上包括有催化部份和底物部份。核酶催化作用的特點

(1)都有一個活性中心，催化時形成中間復合物，具有比蛋白質酶更高的底物特異性；

(2)核酶對底物的切點處序列普遍為

CGU-X(含有 GU序列)。

G基因治療

人工設計的核

酶

黃粗線表示合成的核酸分子黑細線表示天然的核酸分子X表示一致性序列箭頭表示切斷點基因治療核酶在基因治療中的應用▼核酶(RNA)分子活性中心必需基團為必不可少的高度保守序列，其兩端與底物RNA互補的片段則為結合基團。▼在設計人工核酶時，可據靶核酸序列特點，靈活改動與底物結合的兩段序列。▼核酶結構穩定，不易被RNase降解，且可反復發揮作用，其應用日益受到重視。▼如用核酶在培養的白血病細胞中干預癌基因Ha-ras的表達等已見報道。基因治療RNA干涉(擾)(RNAinterference,RNAi)

(補充)RNA干涉(擾)是近年發現的一種序列特異的轉錄后基因沉默現象。其原理簡單地說，RNAi是由雙鏈RNA啟動，導致具有同源序列的mRNA降解。特點與用途：是一項快速有效的、適宜高通量、在基因組范圍進行基因功能分析的強有力技術。基因治療RNAINTERFERENCE

>30basepairdouble-strandedRNACleavagePKRinactivePKRactive2’,5’-ASinactive2’,5’-ASactive(GlobaleffectsInhibitionofproteinsynthesisDegradationofmRNAsShortinterferingRNAs<30basepairsRailDegradationofmRNA(Sequence-specificeffects)基因治療3、自殺基因技術原理：即用（逆轉錄）病毒載體將編碼某種酶的基因（自殺基因）轉染到腫瘤細胞中，此酶可將一種無害的藥物前體轉變為細胞毒復合物，進而殺傷腫瘤細胞（腫瘤細胞不能復制而死亡）。這種基因載體只能在特定的組織或腫瘤中表達，而正常細胞中不表達。自殺基因:前體藥物酶轉化基因基因治療自殺基因(suicidegene)的功能如下圖所示：

細胞藥物前體自殺基因

+

病毒載體

(無毒)

轉染

重組載體

gene

酶

藥物復合物

(有毒)

細胞死亡基因治療

自殺基因應用舉例：

單純皰疹病毒哺乳動物細胞

HSVGene-TK

（在腫瘤細胞中表達，正常細胞中不表達）Gene—TKGCV（胸苷類似物）

ATPTdRTKATPGCV---pTK抑制DNA合成

TdR-5’-P腫瘤細胞死亡(脫氧胸苷酸)

鄰近細胞死亡凋亡（旁觀者效應）另一自殺系統(E.coli):CD/5-FC(略)。基因治療四、遺傳病的基因治療前言：人類遺傳變異4000多種；其中遺傳病約3000種。當前，以基因治療方法醫治的單基因缺陷遺傳病有:

85％患者

ADA缺陷病SCID

囊性纖維變性家族性高膽固醇血癥血友病B

粘多糖沉積癥等等。基因治療(一)腺苷脫氨酶(ADA)缺陷病的基因治療1.腺苷脫氨酶缺陷病的分子機制人腺苷脫氨酶(adenosinedeaminase,

ADA)的基因定位

ADA基因定位于染色體20q12-q13.11，基因全長32kb(含12個外顯子、11個內含子)，

mRNA長1530bp(翻譯產物ADA含362個aa殘基)。基因治療ADA缺陷導致SCID的分子機制腺苷脫氨酶（ADA）和嘌呤核苷

磷酸化酶（PNP)缺陷引起的SCID

ADA或PNP缺失導致dATP或dGTP在細胞內積蓄，對早期T、B細胞發育有毒性作用，使之停滯于pro-T/pro-B階段，引起SCID.基因治療AMP

IMP

腺苷肌苷

PNP腺苷

脫氧腺苷dAMPdADPdATP抑制核苷酸還原酶T、B細胞增殖障礙6-氧嘌呤GMP鳥苷PNP鳥嘌呤黃嘌呤鳥苷脫氧鳥苷dGMPdGDPdGTP尿酸ADA抑制脫氧核苷酸合成進而抑制DNA合成基因治療網狀細胞發育不全造血干細胞

髓紅系干細胞SCID淋巴干細胞前B細胞

前T細胞

SCID胸腺B淋巴細胞漿細胞免疫細胞分化途徑記憶B細胞T淋巴細胞(部分)與免疫缺陷嚴重聯合型免疫缺陷(SevereCombined

Immunodeficiency，SCID)基因治療2.ADA缺陷病的基因治療研究用RV載體轉染高效表達+SV40啟動子重組體小鼠、人淋巴細胞持續數月+ADA基因(體外培養)ADA缺陷基因治療的早期實驗研究(Culveretc.)

基因治療第二個時期(Farrarietc.)用RV載體將人ADA基因導入體外培養的小鼠外周血淋巴細胞，然后回輸給ADA缺陷小鼠的血液系統(結果：小鼠血中出現Ig及抗原特異性T淋巴細胞)基因治療第三個時期(Kantoffetc.)用RV載體將人ADA基因導入猴的骨髓造血干細胞，然后回輸到被放射性破壞造血系統的猴的體內.(結果：實驗猴均重建造血系統，有ADA基因表達，動物存活9個月以上，且具無并發癥的安全性)。通過上述三個時期的實驗研究和實驗資料的積累，足可過渡到臨床基因治療。基因治療3.ADA缺陷的臨床基因治療ADA-gene+vector（逆轉錄病毒）

重組分子患者TLyC

IL-2刺激C分裂

導入生長、分裂的細胞

10天

ADAgene表達

回輸患兒體內

1~2月治療一次,10.5個月后患兒體內ADA水平達正常人的25%

基因治療(二)血友病B的基因治療(略)(三)家族性高膽固醇血癥的基因治療(略)五.腫瘤的基因治療疾病本身的特殊性決定治療方法和手段的特殊性目的基因和靶細胞的選擇:受限制少、靈活；治療的策略多樣性；。一般地，按作用機制，腫瘤基因治療策略分為三大類:基因治療(一)抑制和殺傷腫瘤細胞自殺療法早期研究將自殺基因(如藥物前體轉化酶的基因)導入腫瘤細胞，該基因產物能使無毒的藥物前體轉變為細胞毒性藥物，從而使腫瘤細胞‘‘自殺’’。應指出，上述實驗的對象是體外培養的腫瘤細胞。特點：在人和動物體內，很難保證自殺基因的組織特異性表達。基因治療自殺基因在腫瘤組織中的特異性表達AFPgenepromoter重組包裝細胞系假病毒+VZV-tk(目的基因)逆轉錄病毒顆粒+RV載體