層析分離純化技術內容提要1、層析原理與操作2、蛋白質純化策略

生命科學與生物技術生物分離技術基因重組技術免疫檢測技術從基因組到蛋白質從有限到無限離心沉淀電泳層析層析原理與操作

層析的起源和原理起源1906年，俄國植物學家Tsweet原理利用物質分配系數不同達到分離目的原理與操作Chromatography層析色譜什么是生物層析

根據生物分子物理化學特性的不同而達到分離

極性：polarity(solubility,volatility)HIC,RP

離子特性：ioniccharacteristics(charge)IEX

大小與形狀：size/mass(diffusion,sedimentation)GF

結構特征與活性位點：shape(ligandbinding,affinity)AC

這些特性的區別使不同分子在層析的固定相和流動相的分配不同而達到分離原理與操作層析技術

IonExchange(IEX)－離子交換電荷–可用于層析的任何步驟，根據純度要求，包括粗純捕獲、中間純化和最后的精細純化SizeExclusion(SEC)－分子篩（或凝膠過濾）分子大小–用于中間純化、脫鹽和緩沖液交換、最后精細純化Affinity(AC)－親和生物相互作用

–用于復雜樣品的最早捕獲或中間純化HydrophobicInteraction(HIC和RP)－疏水和反相疏水相互作用-用于中間純化，去除脂類和脂多糖CeramicHydroxyapatite(CHT)&CeramicFluoroapatite(CFT)－羥基磷灰石獨特分離機理，包含離子交換和金屬螯合等,可用于層析的任何步驟，根據純度要求，包括粗純捕獲、中間純化和最后的精細純化原理與操作液相層析

最廣泛的蛋白質分離純化方法

條件溫和

維持蛋白質空間結構與活性

基于蛋白質對固定相的不同保留達到分離

蛋白質溶于流動相中，經過裝填固定相的柱子分離原理與操作層析的5個操作步驟裝柱并平衡上樣平衡洗脫再生上樣裝填有層析介質的層析柱分離分離組分流出原理與操作層析圖原理與操作第一峰,外水體積,Vo,不與柱中填料相互作用直接從柱中流出。這是樣品中的未結合物質VoVeVt蛋白質含量(A280),由UV檢測器讀出，y軸基線洗脫峰，有些可以很好的分離，有些分得不是很好，有部分交叉有時這里也顯示梯度濃度等檢測值時間或體積，x軸DuoFLow軟件系統非常直觀，易學簡單明快，4個步驟進入操作：

BrowserSetupProtocolRun

觀察樣品情況,調節色普圖和峰高度

orGoDoSomethingElse!快速啟動功能：2次擊鍵進入操作

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–EnterUserandMethodNameDuoFLow軟件系統Setup–selecthardwareDuoFLow軟件系統Protocol–entermethodDuoFLow軟件系統PostRunOptions-Activity

DuoFLow軟件系統PostRunOptions–PeakTaggingDuoFLow軟件系統PostRunOptions–TRACECOMPARE層析圖比較

單一柱子單一程序走不同樣品單一樣品和單一程序走不同柱子同一樣品和柱子走不同程序DuoFLow軟件系統DuoFLow軟件系統DuoFLow軟件系統純化平臺的硬件結構——

層析介質與層析柱，原理與技術層析介質離子交換層析介質

UnosphereQ，S

MacroPrepHighQ,HighS,DEAE,CM親和層析

ProfinityIMAC金屬螯合介質

Profinity

Epoxide環氧親和介質

Affi-GelProteinA,

Affi-PrepProteinA

Affi-Gel藍膠，DEAE藍膠，CM藍膠

Affi-Prep多粘菌素介質

Affi-Gel硼膠

Affi-Gel配體固定化活化介質凝膠過濾層析介質

Bio-GelP系列

Bio-BeadsS-X介質羥基磷灰石介質（CHT）氟代羥基磷灰石介質（CFT）疏水層析介質

Macro-PrepMethylHICMacro-Prept-ButylHICBio-BeadsSM-2吸附劑層析柱分析柱離子交換分析柱：UnoQ,S

Aminex分析柱——分析單糖、寡糖、有機酸、有機堿，以及肽和核酸有機小分子羥基磷灰石分析柱：Bio-ScaleCHT-I

凝膠過濾分析柱：Bio-Sil,Bio-SilectHPLC分析柱反相層析分析柱：Hi-PoreRP304,Hi-PoreRP318各種層析介質的Cartridges——用于條件摸索

MacroPrepCHTHICBio-ScaleMiniCartridgesUNOColumn層析介質結構原理UnosphereMacroPrep離子交換層析Q，S，DEAE，CM疏水層析-CH3,t-Butyl親和層析ProteinAIDA－Ni多粘菌素凝膠過濾CHT和CFTUnosphereQ,SMacroPrepHighQ,SMacroPrepDEAE,CMMacroPrepMethylHICMacroPrept-ButylHICProfinityIMACProfinity

EpoxideAffi-GelProteinA,Affi-PrepProteinAAffi-Gel,DEAE,CMAffi-PrepPolymixinAffi-Gel硼膠Affi-Gel配體固定化活化層析介質及其技術凝膠過濾層析離子交換層析羥基磷灰石層析疏水層析親和層析凝膠過濾層析分離純化原理1001,00010,000100,000Bio-GelP2Bio-GelP4Bio-GelP6Bio-GelP10Bio-GelP30Bio-GelP60Bio-GelP1001,8008004,0001,0006,000，用于脫鹽1,50020,0002,50040,0003,00060,0005,000100,000100凝膠過濾層析凝膠的選擇柱長的選擇

分離：80－120cm

脫鹽：30cm以下

洗脫液

離子強度低高離子作用排阻作用（0.05-0.2M)疏水作用pH——中性流速，根據層析介質的說明，一般很低樣品容量：1－3％CV凝膠過濾層析操作參數選擇1.可分離相對分子量從幾百到幾十萬的物質

具有3000個理論塔板的凝膠過濾可將分子量相差2倍的蛋白質完全分開,6000個理論塔板的可將分子量相差1.5倍的蛋白質完全分開;建議柱高在80-120cm,直徑=H/302.脫鹽凝膠過濾層析凝膠過濾層析的應用cationweakstronganionweakstrongDEAEDiethylamino-ethylQQuaternaryamineCMCarboxy-methylSSulfonate離子交換層析離子交換層析類型及其選擇-O-CH2CH2-NH+C2H5C2H5-N+(CH3)3-O-CH2-C-O-O-SO3-pIstabilityrangestabilityrange與陽離子交換介質結合+-denaturationdenaturationpH102離子交換層析離子交換層析原理——蛋白質滴定曲線蛋白質凈電荷與陰離子交換介質結合Products:UNOsphere?Q&S,Macro-Prep?HighQ&S,CM,DEAE,AG?resinsEquilibrationSampleApplicationSampleAdsorptionElutionRegeneration--++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++-----++++++++++++++++++++++++++++++------------++++++++++++++++++++++++++++++離子交換層析離子交換層析原理離子強度洗脫時多采用離子濃度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等.

在不同鹽濃度（離子強度）及其不同變化率（梯度）條件下保留行為不同，需對該條件進行摸索。一般的，隨離子強度增加，蛋白質保留值減小。緩沖液與pH

選擇適當的緩沖體系，起始濃度要盡可能低些(0.01-0.05M)

緩沖液PH值：陽離子低于pI一個pH單位以上陰離子通常高于pI一個pH單位以上

蛋白質在不同pH下保留行為差別較大，所以許對緩沖體系和操作pH進行摸索，以得到最佳層析條件。離子交換層析離子交換層析操作參數選擇pI＝5.5+-pH102離子交換層析緩沖液與pHpI＝7.5陽離子交換陰離子交換堿性蛋白，采用陽離子交換酸性蛋白，采用陰離子交換蛋白質凈電荷pH4.0pH9.0蛋白質穩定性范圍Columns

MediaBio-ScaleQ Macro-PrephighQBio-ScaleDEAE Macro-PrepDEAEBio-ScaleS Macro-PrephighSBio-ScaleCM Macro-PrepCM Macro-Prep25Q Macro-Prep25DEAE Macro-Prep25SUNOQ UNOsphereQUNOS UNOsphereS離子交換層析離子交換層析產品50um25um120um80um10um更高的選擇性和分辨率10%穿透載量:UnosphereQ:>150mg/mlBSA@600cm/hrUnosphereS:>30mg/mlBIgG@600cm/hr高流速，低反壓

－操作壓力:<2bar@1200cm/hrwith20cm更高的堿穩定性短期:1.0MNaOH@RTfor>1week長期:Storagein0.1MNaOH@RTfor>1year生產效率大大提高離子交換層析UNOsphereQ/S性能參數Ca2+PO3-4CrystalFormationCrystalDryingAndGranulationSinteringAtHighTemperature羥基磷灰石（CHT）合成Ca10(PO4)6(OH)25個帶正電荷的Ca離子對（C位點）2個磷酸三價離子，每個含有帶6個負電荷的氧原子（P位點）2個羥基于其他層析介質不同，CHT的骨架是化學反應的表面CHT陶瓷羥基磷灰石晶體結構羥基磷灰石（CHT）羥基磷灰石（CHT）產品類型與參數蛋白質帶正電氨基經典的陽離子交換用中性鹽溶液

(NaCl)或緩沖鹽溶液

(PO4)洗脫羥基磷灰石（CHT）初級保留機制帶負電羧基經典的金屬螯合作用，并受離子排阻調節比離子間靜電相互作用強15–60倍在無PO4

條件下不能被任何濃度NaCl洗脫用PO4洗脫初級保留機制羥基磷灰石（CHT）大部分大分子蛋白質以兩種保留機制聯合模式結合：Ca親和與陽離子交換酸性蛋白質的結合，如白蛋白（albumin）以鈣親和作用為主，陽離子交換僅有輕微的作用，這意味著NaCl對白蛋白載量和保留的影響是非常有限的。堿性蛋白質，如IgG以陽離子交換作用為主，其載量和保留受NaCl影響顯著注：對于帶負電荷的酸性蛋白質，無論樣品是否含有NaCl，都對上樣時的吸附載量和保留無影響，這意味著可以將捕獲階段獲得的中間體樣品無需脫鹽處理即可上樣到CHT上進行高分辨率中間純化羥基磷灰石（CHT）混合保留機制TypeI由于具有更高的表面積，I型具有更高的蛋白載量，而且具有更大的保留.TypeII由于具有大孔結構，II型具有更高的核酸載量，能分離單鏈和雙鏈DNA，和超螺旋與非超螺旋的DNA白蛋白不能與II型結合，對于一些含白蛋白的抗體樣品，II型分離純化更有利.大分子重組疫苗的中間純化和大規模制備如何選擇類型羥基磷灰石（CHT）分離純化原理與操作參數選擇羥基磷灰石（CHT）影響蛋白質色譜行為的操作參數：

CHT類型

NaCl濃度

PB緩沖液濃度梯度雙梯度洗脫

PB緩沖液梯度含不同NaCl濃度緩沖液pH值雙梯度洗脫模型先以0-500mMNaCl，再以0-500mM磷酸鉀不同類型CHT陶瓷羥基磷灰石在不同pH下不同蛋白質的保留時間（min）羥基磷灰石（CHT）基于生物分子表面疏水性不同而達到分離的技術疏水作用來自于分子的水化結構，高濃度鹽溶液破壞生物分子的水化結構，使蛋白質內部的疏水基團暴露于分子外表面，從而可與疏水介質結合不同離子的疏水性Anions:SO42->Cl->Br->NO3->ClO4->I->SCN-Cations:Mg2+>Li+>Na+>K+>NH4+蛋白質以高濃度鹽溶液結合與疏水層析柱上，以低濃度鹽溶液洗脫原理疏水層析MacroPrepMethylHICMacroPrept-ButylHIC產品操作參數選擇疏水層析疏水介質選擇：甲基，丁基，苯基疏水

疏水性強的蛋白質：甲基，丁基疏水性弱的蛋白質：丁基，苯基鹽：硫酸銨，醋酸銨等等緩沖體系和pH洗脫梯度DefinitionSeparationofproteinsbasedonreversibleinteractionsbetweenaproteinandaspecificligandcoupledtothestationaryphaseAffinityChromatography

PrincipleProfinityIMAC——純化His-taggedProteinChelex100——純化DNA，PCR樣品制備Affi-GelProteinA——純化單克隆抗體Dye-Affi-GelBlue(DEAEorCM)

——純化單抗，分離HSAAffi-Gel肝素凝膠——多種蛋白，如凝結因子、蛋白酶、核酸酶、脂酶Affi-GelPolymixin——去除內毒素（熱原）Affi-Gel硼膠——分離核苷酸、核苷、兒茶酚胺、糖類等小分子親和層析產品與應用ProfinityIMACResins固定化金屬螯合層析：ImmobilizedMetalAffinityChromatography（IMAC）

基于純化重組組氨酸標記蛋白設計，專門純化His-taggedProtein

螯合帶電離子，如Zn2+,Ni2+,Cu2+,現有的產品為螯合Ni2+的介質

UNOsphere

技術

更好的流動特性，在高流速下載量，目的蛋白得率和純度不會受到影響。IDACartridgesBio-ScaleMiniCartridges

ProfinityIMACNi金屬螯合——純化His-Tagged重組蛋白質

GST-Tagged重組蛋白質柱:1ml和5ml兩種規格

ProteinA抗體親和柱

Affi-GelBlueGel藍膠

DEAE藍膠預裝柱：用于純化抗體，5ml規格

Bio-GelP-6脫鹽柱：5ml、10ml和50ml三種規格

UNOsphereQ/S強陰/陽離子交換：1ml和5ml兩種規格

DEAE弱陰離子交換：1ml和5ml兩種規格

CHT-I和II型預裝柱（即將上市）HPLC分析柱Aminex分析柱專業用于分析單糖、糖醇、寡糖、有機酸、以及肽和核酸等有機小分子獨特的混合分離機理：涉及離子排阻、離子交換、配基置換、分子排阻、反相和正相等各種分離機理的作用。可分離各種單糖、糖醇、寡糖、有機酸以及小肽和氨基酸等等物質。應用范圍包括林學研究、酶學研究、各種發酵以及發酵液分析與質控，醫藥中間體質控等等分離純化的目的以最簡單的技術最少的步驟，最高的收率，最低的成本，生產合格產品。蛋白質純化策略樣品準備捕獲中間純化精純故事剛剛開始…層析的目標

目標

純度，Purity(>90%vs.≥99.9%)

活性，Activity(activevs.inactive)

含量，Quantity(ngormglevels)

關鍵雜質的對數減少，Logreductionsofkeycontaminants

必須了解的蛋白特性分子量與等電點

pH、溫度穩定性，pH,tempstability

鹽、去污劑、有機溶劑和金屬離子的影響

Effectsofsalt,detergents,organicsolvents,metalions

后轉錄修飾，Post-translationalmodifications

選擇層析類型

變性/非變性，Denaturing/non-denaturing

分辨率，Resolution

得率，Yield

速度，Speed

BeforeStarting…蛋白質純化策略ProteinPropertiesDetermineBestResinMolecularBiologyofTheCell,3rdEd.,Albertsetal-+His6IMACNi++,Co++ProteinACibacronBlueF3GA-OCH3HIC-OCH(CH3)3CHTCa++,PO4--QResins-N+(CH3)3SResins-SO3-CMResins-CH2COO-SEC(GF)DEAE-N+H(CH2CH3)2工藝策略樣品準備技術手段：離心，沉淀（硫酸銨、等電點、有機溶劑），過濾，超濾包涵體表達的樣品：菌液分離，包涵體提取和清洗，包涵體溶解，復性細胞周質表達的樣品：菌液分離，反滲透破菌，沉淀和超濾分離細胞和酵母等真核分泌表達的樣品：菌液分離，超濾或直接捕獲純化天然生物材料樣品純化未知蛋白質：不同來源樣品處理方法不同：

各種微生物發酵液和細胞培養液、動物天然樣品（蛇毒、蟾毒、昆蟲）、植物天然樣品等等工藝策略重組蛋白質樣品分析表達豐度胞內，胞外表達量：樣品純度×樣品蛋白質濃度×樣品體積主要雜蛋白：白蛋白，血清蛋白，培養基蛋白，胞內各種雜蛋白，內毒素等等包涵體菌液分離，破菌，提取，含量和純度分析洗滌：1%的中性去垢劑，如Tween、TritonX-100等，加EDTA和還原劑2-巰基蘇糖（DTT）、β-巰基乙醇等等，低濃度鹽酸胍或尿素捕獲:

快速去除關鍵雜質，例如能降解目標蛋白的組分，如蛋白酶等，濃縮樣品，去除高峰度雜質蛋白中間純化:

去除大部分殘留的雜質蛋白精細純化：

去除與目標蛋白性質接近的殘留少量或微量雜質蛋白工藝策略工藝策略菌液分離，澄清脫鹽捕獲中間純化精純濃縮離子交換親和CHT羥基磷灰石疏水親和離子交換凝膠過濾（分子篩）親和HPLC80－120um40－80um10－50um層析介質顆粒大小各步驟的評價參數

純度得率生物活性工藝時間載量流速分辨率得率工藝策略各步驟的評價方法

電泳：SDS，PAGE

蛋白質濃度測定生物活性測定

HPLC分析IEXCHTIEXAffinitySECAmmoniumsulfateHICCHTAffinitySECAffinityCHTIEXSEC工藝路線選擇1、IEX——IEXMacro-PrepHighQ和HighS兩步純化IgMFEA

BCD

GH0.5-0.4-0.3-0.2-0.1-0.0-

||||||

|

0.0

2.5

5.07.510.012.515.0

litersAU(2mm)cond.A280DA

B

CFGE0.20-0.15-0.10-0.05-0.00-

|

|

|

|

|

|

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

litersAU(2mm)cond.A280HighS的初純HighQ的精純工藝路線選擇200116

97

66

55

36

31

22

14

61

2

3

4

5

6

7

8

9

10kDaLane Sample 1 MWStandard 2 Bioreactorsup(reduced) 3 Bufferexchangedmaterial(reduced) 4 PartiallypurifiedIgMfromcationstep(reduced) 5 HighlypurifiedIgMfromanionstep(reduced) 6 MWStandard 7 Bioreactorsup(non-reduced) 8 Bufferexchangedmaterial(non-reduced)

9 PartiallypurifiedIgMfromcationstep(non-reduced) 10 HighlypurifiedIgMfromanionstep(non-reduced)1、IEX——IEXMacro-PrepHighQ和HighS兩步純化IgM工藝路線選擇2、IEX——CHTUNOsphereS和CHT羥基磷灰石兩步純化鼠mAb

IgG工藝路線選擇UNOsphereS初純CMUNOspherePACHTCHT2、IEX——CHTUNOsphereS和CHT羥基磷灰石兩步純化鼠mAb

IgG工藝路線選擇CHT精純3、Affinity——IEX——CHT純化mAb工藝路線選擇原理ProteinAtoremovethebulkof