9（規范性）產品微生物檢測方法B.1產品采集與樣品處理于同一批號的3個運輸包裝中至少抽取6件最小銷售包裝樣品（若樣品數量不能滿足試驗所需，則應相應增加采樣數量其中1/3樣品用于檢測，2/3樣品用于留樣。抽樣的最小銷售包裝不應有破裂，檢驗前不得開啟。在空氣潔凈度5級凈化條件下用無菌方法打開至少2個包裝用于檢測，從每個包裝中取樣，準確稱取10.0g±1.0g樣品。剪碎后加入到200mL滅菌生理鹽水中，充分混勻，得到一個生理鹽水樣液（若產品太輕，可稱取2.5g±0.2g樣品，加入50mL滅菌生理鹽水中）。液體產品吸取10.0mL原液直接作樣液。如被檢樣品具有抑菌或抗菌作用，應選擇適宜的中和劑中和，稀釋梯度最高不超過1∶100。無相應中和劑則選用薄膜過濾法去除樣品中對微生物生長有影響的抑菌或抗菌成分，再按上述方法制備樣液。如被檢樣品含有大量吸水樹脂材料而導致不能吸出足夠樣液時，稀釋液量可按每次50mL遞增，直至能吸出足夠測試用樣液。在計算細菌菌落總數與真菌菌落總數時相應調整稀釋度。B.2初始污染菌與細菌菌落總數檢測方法B.2.1操作步驟按B.1得到的生理鹽水或中和劑樣液自然沉降后取上清液，如需要可進行10倍系列稀釋。選擇適宜的稀釋度進行菌落計數。共接種2個平皿，每個平皿中加入2.0mL樣液，然后用冷卻至40℃~45℃左右熔化的營養瓊脂培養基15mL～20mL倒入每個平皿內混合均勻。待瓊脂凝固后翻轉平皿置36℃±1℃培養48h，計算平皿上的菌落數。B.2.2菌落計數菌落呈片狀生長的平皿不宜采用，確保2塊平皿符合計數要求并進行菌落計數，按公式(B.1)計算結果：At=…………（B.1）式中：At─細菌菌落總數，單位為每克菌落形成單位（CFU/g）或每毫升菌落形成單位（CFU/mL）；A0─2塊營養瓊脂培養基平皿上的細菌菌落總數；K─稀釋倍數；2×2─2塊平皿，每塊平皿接種2.0mL樣液。首先選取平均菌落數在30CFU～300CFU之間的平皿。當菌落數小于或等于100CFU/g或CFU/mL，按實有數報告，大于100CFU/g或CFU/mL時采用二位有效數字；當2塊營養瓊脂培養基平皿上的細菌菌落總數為0CFU時，如為固體應當報告細菌菌落總數小于5CFU/g，如為液體按稀釋倍數報告。B.2.3結果報告B.2.3.1如經首次檢測，樣品細菌菌落總數符合本文件的規定，直接按檢測結果報告。B.2.3.2如經首次檢測，樣品細菌菌落總數超過本文件的規定，應用留存的樣品依前法復測2次，然后才能報告結果。當2次復測結果都達到本文件的規定，則判定被檢樣品合格，以2次合格結果的均值報告；其中有任何1次復測結果超過本文件規定，則判定被檢樣品不合格，以所有不合格結果的均值報告。B.3大腸菌群檢測方法B.3.1操作步驟不產酸也不產氣，則報告為大腸菌群陰性。B.3.1.2分離培養：如產酸產氣，則劃線接種伊紅美藍瓊脂平皿，置36℃±1℃培養18h～24h，觀察平皿上菌落形態。典型的大腸菌落為黑紫色或紅紫色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤，也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紅色，中心較深的菌落。B.3.1.3染色鏡檢與鑒定：取疑似菌落1個～2個作革蘭染色鏡檢，同時接種乳糖發酵管，置36℃±1℃培養18h～24h，觀察產酸產氣情況。B.3.2結果報告凡乳糖膽鹽發酵管產酸產氣，乳糖發酵管產酸產氣，在伊紅美藍平皿上有典型大腸菌群菌落，革蘭染色為陰性無芽孢桿菌，可報告被檢樣品檢出大腸菌群。B.4銅綠假單胞菌檢測方法B.4.1操作步驟養液中，充分混勻，置36℃±1℃培養18h～24h。如有銅養液常呈黃綠色或藍綠色。B.4.1.2分離培養：從培養液的薄菌膜處挑取培養物，劃線接種十六烷基三甲基溴化銨瓊脂平皿，置36℃±1℃培養18h～24h，觀察菌落特征。銅綠假單胞菌在此培養基上生長良好，菌落扁平無定型，向周邊擴散，或蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養基常擴散有水溶性色素。在缺乏十六烷基三甲基溴化銨瓊脂時也可用乙酰胺培養基進行分離，將菌懸液劃線接種于平皿上，放36℃±1℃培養18h～24h，觀察菌落特征。銅綠假單胞菌在此培養基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養基略帶粉紅色。B.4.1.3染色鏡檢：取鑒定培養基上可疑菌落涂片作革蘭染色，鏡檢為革蘭陰性菌者還需進行下列試驗。B.4.1.4氧化酶試驗：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內，用無菌玻棒挑取鑒定培養基上可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的1％二甲基對苯二胺試液，30s內出現粉紅色或紫紅色，為氧化酶試驗陽性，不變色者為陰性。亦可使用商品化的氧化酶試紙或試劑進行檢測。B.4.1.5綠膿菌素試驗：取鑒定培養基上2個～3個可疑菌落，分別接種在綠膿菌素測定用培養基斜面，36℃±1℃培養24h，加入三氯甲烷3mL～5mL，充分振蕩使培養物中可能存在的綠膿菌素溶解，待三氯甲烷呈藍色時，用吸管移到另一試管中并加入1.0mol/L的鹽酸1mL，振蕩后靜置片刻。如上層出現粉紅色或紫紅色即為陽性，表示有綠膿菌素存在。B.4.1.6硝酸鹽還原產氣試驗：取鑒定培養基上可疑菌落接種在硝酸鹽胨水培養基中，置36℃±1℃培養24h，培養基小倒管中有氣者即為陽性。B.4.1.7明膠液化試驗：取鑒定培養基上可疑菌落純培養物，穿刺接種在明膠培養基內，置36℃±1℃培養24h，取出放于4℃~10℃,如仍呈液態為陽性，凝固者為陰性。B.4.1.842℃生長試驗：取鑒定培養基上可疑培養物，接種在普通瓊脂斜面培養基上，置42℃培養24h～48h，有銅綠假單胞菌生長為陽性。B.4.1.9其他檢驗：使用生化鑒定試劑或生化鑒定卡的，依據商品試劑說明書對可疑菌落進行鑒定。B.4.2結果報告被檢樣品經增菌分離培養后，證實為革蘭陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗均為陽性者，即可報告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌。如綠膿菌素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產氣和42℃生長試驗三者皆為陽性時，仍可報告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌。B.5金黃色葡萄球菌檢測方法B.5.1操作步驟B.5.1.1增菌培養：取樣液5.0mL，加入到50mLSCDLP培養液中，充分混勻，置36℃±1℃培養B.5.1.2分離培養：自上述增菌懸液中取1～2接種環，劃線接種BairdParker培養基（首選）或血瓊脂培養基，置36℃±1℃培養24h～48h。在BairdParker培養基上為圓形，光滑，凸起，濕潤，直徑為2.0mm～3.0mm,顏色呈灰色到黑色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶，用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度。偶爾會遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明帶。在血瓊脂平皿上典型菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。B.5.1.3染色鏡檢：挑取典型菌落，涂片作革蘭染色鏡檢，金黃色葡萄球菌為革蘭陽性球菌，排列成葡萄狀，無芽孢與莢膜。鏡檢符合上列情況，還需進行甘露醇發酵試驗和血漿凝固酶試驗。B.5.1.4甘露醇發酵試驗：取血瓊脂平皿上典型菌落接種甘露醇培養液，置36℃±1℃培養24h，發酵甘露醇產酸者為陽性。B.5.1.5血漿凝固酶試驗（試管法）：吸取1:4新鮮血漿或凍干血漿生理鹽水溶液0.5mL，放滅菌小試管中，加入等量待檢菌24h肉湯培養物0.5mL，混勻，放36℃±1℃溫箱或水浴中，每30min觀察一次，24h之內呈現凝塊即為陽性。同時以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養物各0.5mL作為陽性與陰性對照。B.5.1.6其他檢驗：使用生化鑒定試劑或生化鑒定卡的，依據商品試劑說明書對可疑菌落進行鑒定。B.5.2結果報告凡在瓊脂平皿上有可疑菌落生長，鏡檢為革蘭陽性呈葡萄狀排列的球菌，并能發酵甘露醇產酸，血漿凝固酶試驗陽性者，可報告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌。B.6溶血性鏈球菌檢測方法B.6.1操作步驟B.6.1.2分離培養：將培養物劃線接種血瓊脂平皿，36℃±1℃培養18h～24h觀察菌落特征。溶血性鏈球菌在血瓊脂平皿上為灰白色，半透明或不透明，表面突起，圓形，表面光滑，邊緣整齊，周圍有無色透明β型溶血。B.6.1.3染色鏡檢：挑取典型菌落作涂片革蘭染色鏡檢，應為革蘭陽性，呈鏈狀排列的球菌。鏡檢符合上述情況，還需進行鏈激酶試驗和桿菌肽敏感試驗。B.6.1.4鏈激酶試驗：吸取草酸鉀血漿0.2mL（0.01g草酸鉀加5.0mL兔血漿混勻，經離心沉淀，吸取上清液加入0.8mL滅菌生理鹽水，混勻后再加入待檢菌24h肉湯培養物0.5mL和0.25％氯化鈣0.25mL，混勻，放36℃±1℃水浴中，2min觀察一次（一般10min內可凝固），待血察并記錄熔化時間。如2h內不熔化，繼續放置24h觀察，如凝塊全部熔化為陽性，24h仍不熔化為陰性(依據商品試劑說明書)。B.6.1.5桿菌肽敏感試驗：將被檢菌懸液涂于血瓊脂平皿上，用滅菌鑷子取每片含0.04單位桿菌肽的紙片放在平皿表面上，同時以已知陽性菌株作對照，在36℃±1℃下放置24h～48h，有抑菌帶者為陽性。B.6.1.6其他檢驗：使用生化鑒定試劑或生化鑒定卡的，依據商品試劑說明書對可疑菌落進行鑒定。B.6.2結果報告鏡檢革蘭陽性鏈狀排列球菌，血瓊脂平皿上呈現溶血圈，鏈激酶和桿菌肽試驗陽性，可報告被檢樣品檢出溶血性鏈球菌。B.7真菌菌落總數檢測方法B.7.1操作步驟按B.1得到的生理鹽水或中和劑樣液自然沉降后取上清液，如需要可進行10倍系列稀釋。選擇適宜的稀釋度進行真菌菌落計數。共接種2個平皿，每個平皿中加入2.0mL樣液，然后用冷卻至40℃~45℃熔化的沙堡弱瓊脂培養基或改良沙堡弱瓊脂培養基15mL～20mL倒入每個平皿內混合均勻，瓊脂凝固后翻轉平皿置25℃±1℃（沙堡弱瓊脂培養基）或28℃±1℃（改良沙堡弱瓊脂培養基）培養72h，分別于第24h、第48h、第72h觀察，計算平皿上的菌落數，如果發現菌落蔓延，以前一次的菌落計數為準。B.7.2菌落計數菌落呈片狀生長的平皿不應采用；確保2塊平皿符合計數要求并進行菌落計數，按公式(B.2)計算結果：Bt=…………（B.2）式中：Bt─真菌菌落總數，單位為每克菌落形成單位（CFU/g）或每毫升菌落形成單位（CFU/mL）；B0─2塊沙堡弱瓊脂培養基或改良沙堡弱瓊脂培養基平皿上的真菌菌落總數；K─稀釋倍數；2×2─2塊平皿，每塊平皿接種2.0mL樣液。當菌落數小于或等于100CFUCFU/g或CFU/mL時，按實有數報告；當大于100CFU/g或CFU/mL時采用二位有效數字；當2塊沙堡弱瓊脂培養基或改良沙堡弱瓊脂培養基平皿上真菌菌落總數為0CFU時，如為固體應報告真菌菌落總數小于5CFU/g，如為液體按稀釋倍數報告。B.7.3結果報告B.7.3.1如經首次檢測，樣品菌落總數符合本文件的規定，直接按檢測結果報告。B.7.3.2如經首次檢測，樣品菌落總數超過本文件的規定，應用留存的備檢樣品依前法復測2次，然后才能報