本規(guī)范適用于離子阱、單四極桿和三重四極桿型液相色譜-質譜聯用儀(以下簡稱GB/T6041—2002質譜分析方法通則GB/T6682—2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本規(guī)范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本規(guī)范。3.1分辨力resolution分辨兩個相鄰質譜峰的能力，以某離子峰峰高50%處的峰寬度(簡稱半峰寬)表示，記為W?z,單位為原子質量單位(u)。不通過色譜柱，使用注射泵直接將樣品溶液輸入離子源的一種進樣方式。3.3選擇離子監(jiān)測selectedionmonitor對特定質量的單個或多個離子進行檢測的方式，簡稱SIM。3.4選擇反應監(jiān)測selectedreactionmonitor對母離子在特定碰撞能量下產生的子離子進行檢測的方式，簡稱SRM。3.5離子豐度比重復性repeatabilityofabundanceratioofion同一濃度的待測物在相同測量條件下連續(xù)重復測量的離子豐度比之間的重復性。在高電場中對樣品溶液進行霧化以輔助實現電離的方式，簡稱ESI,分為ESI正離3.7大氣壓化學電離atmospherepressurechemic大氣壓電離的一種類型，在大氣壓下樣品通過噴嘴被氮氣流霧化，以電暈或放射源進行電離的離子化方式，簡稱APCI,分為APCI正離子模式(APCI+)和APCI負離LC-MS是將液相色譜儀與質譜儀聯用的儀器，用于樣品定性定量分析。其工作原理為：樣品通過液相色譜分離后的各個組分依次進入質譜檢測器，各組分在離子源被電2離，產生帶有一定電荷、質量數不同的離子。不同離子在電磁場中的運動行為不同，采用質量分析器按不同質荷比(以下簡稱m/z)把離子分開，得到依質荷比順序排列的質譜圖。通過對質譜圖的分析處理，可以得到樣品的定性和定量結果。LC-MS主要包括液相色譜系統、離子源、質量分析器、檢測器、真空系統和數據處理系統等部分。5計量特性LC-MS各項計量性能指標見表1。表1Ee-MS主要計量性能指標儀器類型電離模式分辨力單四極桿、離子阱三重四極桿、單四極枉、離子阱離子阱保留時間重復性’三重四極桿、單四極桿、離子阱6校準條件6.1環(huán)境條件6.1.1儀器室內不得有明顯的機械振動，無電磁干擾，不得存放與實驗無關的易燃、易爆和強腐蝕性氣體或試劑。6.1.2溫度：15℃~30℃。6.1.3相對濕度：不大于80%6.1.4電源電壓：(220±22)V;頻率：(50±0.5)Hz。6.2標準物質和校準設備標準物質均應使用國家有證標準物質，校準設備需經計量檢定合格。6.2.1利血平溶液標準物質，相對擴展不確定度優(yōu)于5%(k=2)。6.2.2移液器或移液管：量程范圍100μL或200μL,B級及以上。36.2.3容量瓶：10mL或25mL,B級及以上。儀器銘牌上標示儀器的名稱、型號、制造廠名、產品序列號、出廠日期等內容。待儀器運行穩(wěn)定后，根據儀器說明書的推薦條件設置參數，將掃描范圍設為m/z=606～612,直接注入(是指流動注射方式，或者使用液相色譜系統的進樣器將樣品不經色譜柱直接注入離子源的方式)或者經色譜柱(液相色譜條件按照附錄B)注入5ng利血平。觀察質譜圖，記錄m/z609質譜峰，并計算其50%峰高處的峰寬，得到Wrz,根據附錄B設定液相色譜條件并優(yōu)化質譜條件，將檢測離子的m/z設為表2中特征離子的m/z,經色譜柱注入相應量的利血平。觀察色譜圖，記錄其色譜峰峰高作為H?。同時記錄信號峰后1min～3min時間內的基線輸出信號的最大值與最小值之差，作為H。根據公式(1)計算信噪比S/N,連續(xù)測量6次，以6次測量S/N的平均值儀器類型電離模式特征離子的m/z609(母離子)→195(子離子)單四極桿、離子阱ESI—單四極桿、離子阱單四極桿、離子阱根據表3和LC-MS質量數應用范圍，選用相應的標準物質或試劑，將掃描范圍設為表3中相應特征離子理論值±5的范圍(例如對于咖啡因，設為m/z=190～200),直接注入相應量的標準物質或試劑。觀察質譜圖，記錄特征離子的實測質量數(有效數字取小數點后兩位)。根據公式(2)計算△M,以△M的最大值作為質量準確性的4M?第i個離子的理論值，u。LC-MS質量數應用范圍標準物質或試劑咖啡因5黃體酮7.5峰面積重復性與保留時間重復性將檢測離子的m/z設為表4中特征離子的m/z,經色譜柱注入相應量的利血平。觀察色譜圖，記錄其色譜峰的峰面積和保留時間。連續(xù)測量6次。根據公式(3)分別計算峰面積與保留時間的相對標準偏差(RSD),作為峰面積重復性與保留時間重復性的結果。式中：x;第i次測量保留時間(min)或峰面積；元6次測量保留時間(min)或峰面積的算術平均值；i——測量序號。儀器類型特征離子的m/z609(母離子)→195(子離子)單四極、離子阱7.6離子豐度比重復性將檢測離子的m/z設為母離子m/z609的兩個子離子m/z397柱注入利血平500pg。觀察質譜圖，分別記錄m/z397和m/z448和m/z448,經色譜的豐度。連續(xù)測量56次，根據公式(4)計算兩個子離子豐度比值的相對標準偏差(RSD),作為離子豐度比重復性的結果：式中：x;——第i次測量的m/z397豐度與m/z448豐度之比；x——6次測量的m/z397豐度與m/z448豐度之比的平均值；i——測量序號。8校準結果校準結果應在校準證書或校準報告上反映。校準證書或報告至少包括以下信息：a)標題，如“校準證書”或“校準報告”;b)實驗室名稱和地址；c)進行校準的地點(如果不在實驗室內進行校準);d)證書或報告的唯一性標識(如編號),每頁及總頁數的標識；e)送校單位的名稱和地址；f)被校對象的描述和明確標識；g)進行校準的日期，如果與校準結果的有效性和應用有關時，應說明被校對象的接受日期；h)如果與校準結果的有效性和應用有關時，應對抽樣程序進行說明；i)對校準所依據的技術規(guī)范的標識，包括名稱及代號；j)本次校準所用測量標準的溯源性及有效性說明；k)校準環(huán)境的描述；1)校準結果及測量不確定度的說明；m)校準證書或校準報告簽發(fā)人的簽名、職務或等效標識以及簽發(fā)日期n)校準結果僅對被校對象有效的聲明；o)未經實驗室書面批準，不得部分復制證書或報告的聲明。9復校時間間隔由于復校時間間隔的長短是由儀器的使用情況、使用者、儀器本身質量等因素所決定，因此，送校單位可根據實際使用情況自主決定復校時間間隔，建議不超過1年。更換重要部件、維修、重新安裝或對儀器性能有懷疑時，應隨時校準。6委托單位聯系電話校準日期 出廠編號設備編號 環(huán)境溫度1外觀檢查2分辨力標準物質濃度進樣量質譜儀類型電離方式調節(jié)方式結果3信噪比標準物質農度進樣量進樣方式掃描范圍電離方式提取離子m/z:4質量準確性標準物質濃度進樣量進樣方式理論值實測值5重復性1)標準物質濃度進樣量進樣方式保留時間123456RSD2)標準物質濃度進樣量進樣方式豐度比123456RSD校準員核驗員7液相色譜和質譜參數(建議條件)B.1液相色譜條件色譜柱：2.1mm內徑的C18色譜柱。液相色譜流動相流速：0.2mL/min～0.4mL/min(不分流)。ESI+與APCI+模式下的流動相：甲醇：水(80÷20,體積分數),加入0.1%(體積分數)甲酸或乙酸。甲酸或乙酸，再加入0.2%(體積分數)氨水。使用GBT6682規(guī)定的一級水，電導率(25℃)≤0.01mSm,0.1%(體積分數)吸光度(254nm,對于信噪比的校準，首先應使用儀器的質譜優(yōu)化功能進行優(yōu)化。可以采用濃度為1.00ng/gL肉利血平溶液標準物質，以直接注入或經液相色譜進樣的方式分別對質譜儀的如下參數進行優(yōu)化，即工細管電、錐孔電壓值、碰撞能量、霧化氣溫度和氣流大小，使利血平在m/2609的離子峰高最高。將質譜采集數據的閱值設為0,其他項目的校準，參照該條件。在離予豐度比重復性校準中，優(yōu)化二級質譜條件時，選擇適當的碰撞能量，使兩個子離子的豐度比值在40%～150%之內，再進行校準8附錄C校準用標準溶液濃度、配制方法及其對應校準項目(建議方法)標準物質或試劑溶劑濃度校準項目利血平溶液標準物質異丙醇水溶液，異丙醇：水=1:1(體積分數)峰面積重復性、液相色譜流動相分辨力、信噪比液相色譜流動相信噪比和峰面積水溶液，甲醇：水=1:1(體積分數)10ng/μL~咖啡因(純度大于95%)甲醇黃體酮(純度大于95%)甲醇注：使用GB/T6682規(guī)定的一級水。9在LC-MS校準中，對信噪比的不確定度進行如下評價。D.1數學模型本校準規(guī)范計算信噪比結果的公式如下，為方便表述，使用z表示信噪比(S/N)H。—HnViH?——提取離子(mí)的色譜峰峰高；K——單位質量響應值，為常數，pg-1;c-所用溶液標準物質的質量濃度，pg/pL;V?—一稀釋溶液標準物質時，移液器或移液管的取液體積，mLV?-稀釋溶液標準物質時，所用容量瓶的體積，mL;從公式(D.1)分析，信噪比的合成度u,)D.2不確定度來源與量化分析信噪比不確定度來源主要包括6個方面，其中測量重復性為A卷不確定度，其他為B類不確定度。D.2.1測量重復性urA測量重復性可以通過計算6次測量平均值的相對標準偏差得到；式中：z——信噪比測量結果，為6次測量的平均值；z;——第i次測量的信噪比結果；s——實驗標準偏差。D.2.2溶液標準物質濃度的相對不確定度u,(c)通過標準物質證書查得標準物質的濃度(c)、擴展不確定度(Ucrm)和包含因子(kcRm),根據下式計算標準物質的相對不確定度：D.2.3移液器或移液管取液體積的相對不確定度u,(V?)對于移液器，通過其檢定證書，查得檢定點為所用的取液體積(V?)對應的容量允許誤差[E(V?),其為相對值],以下式計算該項不確定度：對于移液管，通過其檢定證書，查得標稱容量為所用的取液體積(V?)對應的允差E(V?),按下式計算該項不確定度D.2.4容量瓶體積的相對不確定度u,(V?)通過容量瓶的檢定證書，查得標稱容量(V?)對應的允差E(V?),項不確定度：以下式計算該D.2.5進樣體積的相對不確定度u,(V)一般LCMS采用自動進樣方式，可通過微量注射器的容量允許誤差E(V),以下式計算該項不確定度：D.2.6噪聲強度測量不確定度u,(Hn)噪聲強度的A類不確定度已經在“測量重復性”中計算，該項為噪聲強度的B類不確定度。在實際計算中，將譜圖放大后從軟件上讀取噪聲強度，該項不確定度極小，可忽略。D.3擴展不確定度通過以上分析，將上述各分量代入公式(D.2),計算得到信噪比的相對合成不確定度，取包含因子k=2(95%的置信度),根據下式計算信噪比結果的擴展不確定U=ku,(z)zD.4計算實例以下是一次實際校準不確定度計算實例。此次校準是對三重四極桿LC-MS的校準，進樣量要求為50pg的利血平。使用的標準物質為1.00ng/μL利血平溶液，擴展不確定度為0.05ng/μL,相對擴展不確定度為5%。使用100μL的移液器取上述標準溶液100μL至10mL的容量瓶中，使用流動相溶劑定容至10mL,得到10pg/μL的利血平標準溶液。連續(xù)6次進樣，每次進樣體積為5μL,譜圖略，根據公式(D.1),6次信噪比計算結果分別為：z?=104,z?=100,z?=101,z?=102,zs=100,z6=105。平均值z=102,實驗標準偏差s=1.9。D.4.1測量重復性u:A根據公式(D.3)得：D.4.2溶液標準物質濃度的相對不確定度u,(c)通過標準物質證書查得標準物質的濃度(c=1.00ng/μL)、擴展不確定度(UcrM=0.05ng/μL)和包含因子(kcrm=2),根據公式(D.4)得：D.4.3移液器取液體積的相對不確定度u,(V