土壤質量土壤中無機態氮15N豐度的測定穩定同位素比值質譜法Soilquality—Determinationofnitrogen-15abundanceofinorganicnitrogeninsoil—2023-03-17發布國家標準化管理委員會I前言 12規范性引用文件 13術語和定義 14符號和縮略語 15原理 26試劑和材料 37儀器與設備 48分析步驟 49計算 610測定結果的精密度 611質量保證和控制 7附錄A(資料性)樣品制備裝置(用于微量氮轉化氧化亞氮的輔助裝置)簡介及分析步驟 8參考文獻 9Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中華人民共和國農業農村部提出。本文件由全國土壤質量標準化技術委員會(SAC/TC404)歸口。本文件起草單位：中國科學院南京土壤研究所、中國科學院城市環境研究所、中國科學院亞熱帶農業生態研究所、南京師范大學、上海交通大學、北京科薈測試技術有限公司、江蘇省質量和標準化研究院。1土壤質量土壤中無機態氮15N豐度的測定穩定同位素比值質譜法本文件描述了使用微量氣體預濃縮-同位素比值質譜聯用儀(TGC-IRMS)測定土壤中三種無機態氮(銨態氮NH?+、硝態氮NO?-和亞硝態NO?-)15N豐度的方法。本文件適用于l5N示蹤試驗(fisv≤30%)后混合均勻的土壤。本文件對土壤中銨態氮的定量限為6mg/kg,硝態氮的定量限為3mg/kg,亞硝態氮的定量限為2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6379.2測量方法與結果的準確度(正確度與精密度)第2部分：確定標準測量方法重復性與再現性的基本方法GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T37885化學試劑分類ISO/TS14256-1:2003土壤質量氯化鉀溶液浸提測定新鮮土壤中的硝態氮、亞硝態氮和銨態氮第1部分：手工分析法(Soilquality—Determinationofnitrate,nitriteandammoniumin3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4符號和縮略語下列符號和縮略語適用于本文件。fisv:1N豐度，?N原子在氮元素總原子數中所占的百分比(%)。IRMS:穩定同位素比值質譜儀(IsotopeRatioMassSpectrometer)。R?s:離子流強度比，質荷比(m/z)為45的離子流強度I??與質荷比為44的離子流強度I之比TGC-IRMS:微量氣體預濃縮-同位素比值質譜聯用儀(TraceGasConcentration-IsotopeRatio25原理5.1測定原理采用1mol/L的氯化鉀溶液浸提混合均勻的土壤樣品，再通過氧化還原反應將土壤提取液中的銨態氮、硝態氮和亞硝態氮分別轉化為氧化亞氮。利用TGC-IRMS測定氧化亞氮的15N豐度，再利用換算公式計算銨態氮、硝態氮和亞硝態氮的1?N豐度。5.2銨態氮轉化為氧化亞氮土壤提取液中的銨態氮被加入的次溴酸鹽氧化為羥胺，羥胺被繼續氧化為亞硝酸鹽。亞硝酸鹽與羥胺結合，在銅離子催化下經脫水生成氮氣和氧化亞氮。5.3硝態氮轉化為氧化亞氮土壤提取液中的硝態氮在pH為4.7的條件下被鍍銅鎘粒還原成氧化亞氮。5.4亞硝態氮轉化為氧化亞氮土壤提取液中的亞硝酸鹽在pH低于4時與羥胺反應生成氧化亞氮。5.5轉化反應的化學方程式5.6氧化亞氮氣體中15N豐度的質譜測定將轉化產生的氣體注入TGC-IRMS。氣體中的氧化亞氮經TGC捕集純化，隨載氣進入IRMS的離子源中，電離形成質荷比(m/z)為44、45和46的氧化亞氮分子離子。3種質荷比的分子離子被不同位置的法拉第杯接收并轉化為對應質量數的離子流強度。利用校正后的離子流強度比(R??)可得到氧化亞氮的氮同位素比值。5.7無機態氮15N豐度與生成的氧化亞氮15N豐度間關系5.7.1銨態氮1?N豐度與生成的氧化亞氮1?N豐度間關系見公式(1):fisxNHt=f16NN?0 (1)式中：fisxxnf——銨態氮的1N豐度，%;fisxneo——由銨態氮轉化的氧化亞氮的1N豐度，%。5.7.2硝態氮l?N豐度與生成的氧化亞氮l?N豐度間關系見公式(2):式中：fisxxog——硝態氮的1?N豐度，%;fisxN?o——由硝態氮轉化的氧化亞氮的1N豐度，%。5.7.3亞硝態氮I?N豐度與生成的氧化亞氮1?N豐度間關系見公式(3):3fi?vxo?=2×fisxN?o-0.366………………(3)式中：fisxno?——亞硝態氮的1N豐度，%;fisxn?o——由亞硝態氮轉化的氧化亞氮的1?N豐度，%。6試劑和材料除非另有說明，分析時均使用符合GB/T37885的分析純試劑。6.1試驗用水：應符合GB/T6682中二級水的要求。6.2氯化鉀提取液[c(KCl)=1mol/L]:準確稱取74.55g氯化鉀置于燒杯中，加入800mL水溶解。溶解后轉移到1000mL容量瓶中定容，搖勻。6.3硫酸溶液[c(H?SO?)=0.005mol/L]:在1000mL水中加入0.3mL濃硫酸和0.125g五水合硫6.4氧化鎂(MgO):將氧化鎂置于高溫電爐中，在600℃~700℃溫度下灼燒2h,再放置于干燥器中6.5草酸溶液[c(H?C?O?)=1mol/L]:準確稱取9.004g草酸置于燒杯中，加入約60mL水溶解。溶解后轉移到100mL容量瓶中定容，搖勻。6.6五水合硫酸銅(CuSO?·5H?O)。6.7無灰級濾紙：直徑6mm～7mm的濾紙片。6.8堿性次溴酸鉀溶液。堿性次溴酸鉀溶液應按照以下流程配制：a)準確稱取33.40g溴酸鉀和119.00g溴化鉀至500mL燒杯中，加入一定量(<400mL)水攪拌，充分溶解，轉移并定容至1000mL(溶液應避光保存在棕色試劑瓶中),此為溶液A(溴化鉀-溴酸鉀貯備液);b)量取濃硫酸54.3mL,溶于500mL水中，冷卻后轉移定容至1000mL,此為溶液B(1mol/L稀硫酸);c)準確稱取400.00g氫氧化鈉，緩慢溶解于800mL水中(邊加邊攪拌),冷卻后定容至1000mL(聚乙烯瓶保存，穩定過夜),此為溶液C(10mol/L氫氧化鈉溶液);d)將200mL燒杯置于冰水浴中，量取50mL溶液A至燒杯中，加入25mL溶液B,充分攪拌20s,再緩慢加入25mL溶液C,待溶液冷卻后加入40.00g氫氧化鈉(分批次加入，需充分攪拌以防止體系局部過熱)。配制該溶液需在通風櫥內操作，配制過程宜避光，反應在冰水浴中完成。6.9氨基磺酸溶液[c(NH?SO?H)=0.2mol/L]:稱取1.94g氨基磺酸溶于100mL水中，置于冰箱中6.10醋酸-醋酸鈉緩沖液[c(CH?COOH-CH?COONa)=1mol/L,pH=4.7]:稱取41.00g醋酸鈉溶于500mL水中，再加入30mL無水醋酸，混合均勻。6.11鍍銅鎘粒。6.12鹽酸溶液[c(HCl)=1mol/L]:吸取20mL濃鹽酸溶于220mL水中。6.13鹽酸羥胺溶液[c(NH?OH·HCI)=0.04mol/L]:稱取0.556g鹽酸羥胺溶于200mL水中，該溶液應現配現用。6.14氦氣(He):純度(體積分數)≥99.999%。46.16氧化亞氮(N?O)參比氣體：純度(體積分數)≥99.999%。7儀器與設備7.1溫控搖床：滿足220r/min±20r/min的振蕩頻率和20mm±5mm振幅的控溫搖床。7.2離心機：離心力>3000g,配有100mL聚乙烯離心管。7.3天平：感量分別為0.01g、0.001g和0.0001g。7.4半微量蒸汽蒸餾器：全玻璃封閉型的半微量蒸汽蒸餾器。7.5TGC-IRMS:TGC帶有去除水與二氧化碳的化學阱，配備鍵合聚苯乙烯-二乙烯基苯色譜柱，色譜柱柱長不小于30m,內徑0.32mm;IRMS帶有萬用三杯，連續流模式，分析內精度優于0.06‰。7.6氣密注射器：容積20mL,帶氣鎖。8分析步驟8.1土壤提取液的制備新鮮土壤樣品的處理和貯存，按照ISO/TS14256-1:2003中第5章規定的方法和要求進行。土壤提取液的制備和貯存，按照ISO/TS14256-1:2003中6.1規定的方法和要求進行。8.2無機態氮的轉化8.2.1無機態氮的轉化方法采用化學轉化法(8.2.2～8.2.4)或通過樣品轉化裝置將土壤提取液中的無機態氮轉化為氧化亞氮。樣品制備裝置簡介及其分析步驟說明見附錄A。8.2.2土壤提取液中銨態氮樣品的制備土壤提取液中銨態氮的分離應按照蒸餾法(方法一)或微擴散法(方法二)規定的流程進行。a)蒸餾法(方法一):吸取15mL～20mL(含20μg銨態氮)的土壤提取液，置于半微量蒸汽蒸餾器(7.4)中，加入0.2g氧化鎂(6.4)后立即進行蒸汽蒸餾。用5mL的硫酸溶液(6.3)吸收。蒸汽蒸餾5min,然后濃縮餾出液至2mL～3mL。轉移濃縮液至50mL的反應瓶中，于90℃下b)微擴散法(方法二):如圖1所示，將回形針做成鉤狀，穿過并固定在硅膠片上，再將硅膠片固定于藍蓋瓶瓶蓋上。用鑷子將直徑為6mm～7mm的無灰級濾紙(6.7)穿在回形針掛鉤上，每個掛鉤懸掛2片濾紙片。在藍蓋瓶內預先放入3顆玻璃珠。對于氮質量濃度為2mg/L以上的土壤提取液樣品，移取20mL樣品于250mL的藍蓋瓶中；而對于氮質量濃度低于2mg/L的樣品，則需移取50mL樣品溶液。先用10μL的移液槍在每片無灰級濾紙(6.7)上均勻滴加10μL草酸溶液(6.5),再向樣品溶液中加入0.1g～0.3g的氧化鎂(6.4),迅速旋緊瓶蓋，將藍蓋瓶置于溫控搖床(7.1)內，在25℃±1℃條件下以140r/min±10r/min的轉速振蕩24h。搖動培養結束后，用鑷子小心取出濾紙，放入潔凈的50mL反應瓶中，加入2mg五水合硫酸銅(6.6)并壓緊瓶蓋密封，待測定。5標引序號說明：1—-藍蓋瓶瓶蓋；2——橡膠墊圈；3——回形針；4——加酸濾紙；5——藍蓋瓶；6——無機氮樣品；7——玻璃珠。圖1擴散法反應體系示意圖將含有樣品的反應瓶抽真空，并注入45mL的氦氣(6.14),然后向瓶中注入1mL的堿性次溴酸鉀溶液(6.8),充分搖勻，反應5min。反應產生的氧化亞氮樣品氣體待測定。8.2.3土壤提取液中硝態氮樣品的制備將20mL～25mL的土壤提取液移入150mL硬質三角瓶中，加入2.5mL的氨基磺酸溶液(6.9),加蓋后，置于溫控搖床(7.1)上振蕩5min,以去除土壤提取液中含有的亞硝酸鹽。在一個50mL的反應瓶中，加入50.0mg鍍銅鎘粒(6.11)和5mL醋酸-醋酸鈉緩沖液(6.10),壓緊瓶蓋，抽真空，注入25mL～30mL的氦氣(6.14)。再向反應瓶中注入15mL～20mL(含10μg硝態氮)去除亞硝酸鹽后的土壤提取液。將反應瓶置于溫控搖床(7.1)中，在25℃±5℃條件下以120r/min±10r/min的轉速振蕩24h。反應產生的氧化亞氮樣品氣體待測定。8.2.4土壤提取液中亞硝態氮樣品的制備吸取10mL～25mL(含0.5μg～1μg的亞硝態氮)的土壤提取液置于50mL反應瓶中，壓緊瓶蓋，抽真空，注入20mL～35mL的氦氣(6.14),再向反應瓶中注入1mL鹽酸溶液(6.12)和0.5mL鹽酸羥胺溶液(6.13)。將反應瓶置于溫控搖床(7.1)中，在37℃±1℃條件下以120r/min±10r/min的轉速振蕩16h。反應產生的氧化亞氮樣品氣體待測定。8.3氧化亞氮氣體樣品中15N豐度的質譜測定TGC參數可按儀器說明書或參考如下條件設定：b)捕集流速：25mL/min;6GB/T42488—20238.3.2儀器準備8.3.2.1TGC-IRMS穩定性檢查：連續測定10次氧化亞氮參比氣體(6.16),測定得到的同位素比值的標準偏差應≤0.06%。8.3.2.2TGC-IRMS線性檢查：連續測定10次氧化亞氮參比氣體(6.16),分為5種樣品量梯度，每個梯度測定2次，線性系數應≤0.06‰/V(或0.06‰/nA)。8.3.3樣品分析使用帶鎖定閥的氣密注射器(7.6)從反應瓶中抽取出1mL～3mL(視氧化亞氮濃度而定)的樣品氣體，注入TGC-IRMS(7.5)并在連續流狀態下測定氧化亞氮的1N豐度。9計算9.1富集同位素樣品的穩定同位素組成均以原子百分數(%)表示，樣品中N豐度按公式(4)計算：式中：fisy——樣品中l?NX?v——樣品中l?N豐度，%;的原子數。………………9.2利用校正后的離子流強度比(R?s)計算得到氧化亞氮的I?N豐度，按公式(5)計算：式中：fisxNeo——氧化亞氮的1N豐度，%;R??——校正后的離子流強度比(I??/I?)。注1:土壤中銨態氮的1N豐度通過轉化成的氧化亞氮的1?N豐度計算得到，按公式(1)計算。注2:土壤中硝態氮的1N豐度通過轉化成的氧化亞氮的1N豐度計算得到，按公式(2)計算。注3:土壤中亞硝態氮的1?N豐度通過轉化成的氧化亞氮的1?N豐度計算得到，按公式(3)計算。10測定結果的精密度10.1精密度的計算數據的精密度按照GB/T6379.2的規定確定，重復性和再現性的值以95%置信限計算。10.2重復性在重復性條件下，獲得的兩次獨立測試結果的絕對差值不超過重復性限(r)。本文件三個參數的重復性限(r)見表1。如果差值超過重復性限(r),應當舍棄本次試驗結果并重新完成兩次單個試驗的測定。7在再現性條件下，獲得的兩次獨立測試結果的絕對差值不超過再現性限(R)。本文件三個參數的再現性限(R)見表1。表1三種無機態氮的重復性限(r)和再現性限(R)氮形態NH?+NO?-NO?r/%0.0200.0370.081R/%0.1170.0960.16011質量保證和控制每批測試樣品應帶2個空白試驗樣品。應采用與樣品同一批次的氯化鉀提取液進行空白試驗，空白試驗與測試平行進行，并采取相同的試驗步驟，加入同量的所有試劑。空白試驗樣品產生的質荷比(m/x)44的峰值應低于100mV(或100nA)。每批樣品測試時應包含樣品總數5%的平行樣品。平行樣品的測定結果應滿足第10章的規定。采用質量平衡法，以已知1N豐度的含氮化合物配制成梯度15N豐度的工作標準溶液，采用多點(>3)線性擬合的標準曲線進行校正時，應滿足R2≥0.999。每批樣品測定中，應插入含已知1?N豐度含氮化合物的氯化鉀溶液，測定結果應滿足第10章的規定。8(資料性)樣品制備裝置(用于微量氮轉化氧化亞氮的輔助裝置)簡介及分析步驟A.1樣品制備裝置簡介目前已有可自動將微量氮轉化成氧化亞氮的樣品制備裝置。它包括自動進樣器、160位氣體樣品盤(與10mL反應瓶匹配)、自動氣體抽真空與清洗系統、自動氣體注入系統、自動加液系統以及控制系A.2銨態氮的測定吸取蒸餾的餾出液1mL轉移至10mL反應瓶中，于90℃下繼續濃縮至干，或者封上帶有透氣孔的瓶蓋于一80℃超低溫冰箱中預凍10h后在冷凍干燥機上冷凍干燥24h。取出反應瓶蓋上密封瓶蓋，轉移至樣品制備裝置的樣品盤上，選擇并運行抽真空程序。完成抽真空后，再將功能通道旋轉至自動加液模式，加入1mL的堿性次溴酸鉀溶液(6.8),生成氧化亞氮氣體，等待1min～2min,待反應完全后，將裝置的功能通道旋轉至注氣程序，注入10mL～15mL的氦氣，即可將瓶中的氧化亞氮氣體直接用帶自動進樣器的TGC-IRMS(7.5)進行測定。A.3硝態氮的測定吸取1mL樣品溶液于10mL反應瓶中，蓋上密封瓶蓋，轉移至自動樣品制備裝置的樣品盤上，將裝置功能通道旋轉至自動加液模式，加入0.5mL氨基磺酸溶液(6.9),取出反應瓶振蕩5min,