第八章

蛋白質及氨基酸的測定第一節1.蛋白質的元素組成(The·C:50-55%N:15-18%O:20-23%·

H:6-8%S:0-4%●微量元

素：

P、Fe、Zn、Cu2、

基本結構單位：氨基酸

3、蛋白質的變性作用。概述elements

of

protein)4、

蛋白質分

析的

重

要

性·

生物活性測定·

功能性質調查。

營養標簽總蛋白質含量氨基酸組成蛋白質的營養價值凱氏定氮法杜馬斯法福林酚法染色法5、

蛋白質

的

測

定

方

法利用特定氨基酸殘基法利用蛋白質共性的方法第二節

蛋白質的定性測定一

、蛋白質的一般顯色反應電泳或紙層析之后用一些染料與蛋白質結合并變色。書中列舉了5種染料。二

、復合蛋白質的顯色反應(

一)糖蛋白的顯色(3種方法)(二)脂蛋白的顯色(2種方法)蛋白質的測定方法。1

凱

氏

定

氮

法(1833年Kieldahl,常量法、微量法、自動定氮儀、半微量法。改良凱氏定氮法)·

2雙縮脲法·

3福林酚(Lowry)法·4Bicinchoninic

Acid

法·

5280nm

紫外吸收法·

6染色法

6.1陰離子染色法7

茚三

酮法。8比濁法·

9杜馬斯法(燃燒法)·

10紅外光譜法··6.2布蘭德福特

(Bradford)

法一

、凱氏定氮法(常量)凱氏定氮法通過測出樣品中的總含氮量再乘以

相應的蛋白質系數而求出蛋白質含量的，由于樣

品中常含有少量非蛋白質含氮化合物，故此法的

結果稱為粗蛋白含量。此外，雙縮脲法、染料結合法、酚試劑法等

也常用于蛋白質含量測定，由于方法簡便快速，故多用于生產單位質量控制分析。原理o樣

品與濃硫

酸

(

氧

化

、

脫

水)和

催

化

劑

(硫酸銅)一

同加熱

消

化

，

使

蛋

白

質分解，其中C,H

氧化為COz

和H?O,

有機N轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨。

加堿蒸餾時氨蒸出，用硼酸吸收后，再以標準鹽酸或硫酸溶液滴定。。樣品制備·消化。中和、蒸餾·

滴定·

計算利用換算系數可以把氮的百分含量轉化成樣

品粗蛋白質含量。由于大部分蛋白質含有16%

的氮，所以其換

算

系

數一般為6.25(100/16=6.25)。即：%N×6.25=%蛋白質蛋

白

質

含

量換算系數蛋或肉16.06.25牛

奶15.76.38小

麥18.765.33玉

米17.705.56燕

麥18.665.36大

豆18.125.52大

米19.345.17部

分

食

品

的

蛋

白

質

換

算

系

數在

消化反應中，為了加速蛋白質的分解，

縮短消化時間，常加入下列物質1)

硫酸鉀：提高溶液的沸點，加快有機物分解。它與硫酸作用生

成硫酸氫鉀可提高反應溫度，

一般純硫酸的沸點在340℃左右，而添加硫酸鉀后，可使溫度提高至400℃以

上，原因主要在于隨著消化過程中硫酸不斷地被分解，

水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大，故沸點升高，其反

應式如下：K?SO?+H?SO?→2KHSO?2KHSO?→K?SO?+H?O↑+SO?。硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系

溫度過高，又會引起引起生成的銨鹽發

生熱分解放出氨而造成損失。。除硫酸鉀外，也可以加入硫酸鈉、氯化

鉀等鹽類來提高沸點，但效果不如硫酸鉀

。(2)

(催化劑、指示劑)硫酸銅起催化劑的作用。使用時常加入少量過氧

化

氫，次氯酸鉀等作為氧化劑以加速有機

物氧化。指示消化終點的到達，為清澈的藍綠色。指示蒸餾時的堿加入量是否足夠。除硫酸銅外，還有氧化汞，汞、硒粉，二氧化鈦等也可用的催化劑。電爐吸收液b.蒸餾吸收裝置常量凱氏定氮消化、蒸餾裝置冷凝管凱氏燒瓶裝置玻璃珠蒸餾燒邦電爐a.情化裝置圖9一

1進樣漏平鐵支架鐵支架操作步驟消化準確稱取固體樣品0.2～2g

(半固體樣品2～5g,液體樣品10～20ml)→移入凱氏燒瓶

→

加入研細

的硫酸銅0.5g、

硫酸鉀10g和濃硫酸20ml→搖勻

→

安裝消化裝置

→

于凱氏瓶口放一漏斗

→

以45°角

斜支于有小孔的石棉網上

→

用電爐先以小火加熱至內容物全部炭化，泡沫停止后

→

加大火力保持瓶內液體微沸

→

至液體變藍綠色透明

→

繼續加熱

微沸30分鐘

→

冷卻

→

定容。加入玻璃珠數粒以防蒸餾時暴沸。蒸餾吸取5mL稀釋后的消化液

→

加入凱氏定

氮儀內

→

加10mL40%

的氫氧化鈉

→

夾好漏斗

夾

→

冷凝管下端插入吸收瓶液面下(瓶內預

先裝入10ml4%硼酸溶液及混合指示劑)

→

加熱蒸餾至氨全部蒸出(由紅變藍后約10分

鐘)

→

將冷凝管下端提離液面

→

用蒸餾水

沖洗管口

→

繼續蒸餾1分鐘

→

加熱。滴定將上述吸收液用0.1000

mol/L鹽酸標準溶

液直接滴定至由藍色變為微

紅

色(用甲基

紅一溴甲酚綠混合指示劑)即為終點，同

時作一試劑空白。計算o

Page

158公式。當樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30%過氧化氫2～3ml后再繼續消化。·一般消化至呈透明后，繼續消化30分鐘即可，但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，

如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨

酸等時，需適當延長消化時間。有機物如分解

完全，消化液呈藍色或淺綠色，但含鐵量多時，

呈較深綠色。。蒸餾裝置不能漏氣。。蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍色不生成氫氧化銅沉淀，此時需再增加氫氧化鈉用量。。硼酸吸收液的溫度不應超過40℃,否則對氨的吸收作用減弱而造成損失，此時可置于冷水浴中使用。。蒸餾完畢后，應先將冷凝管下端提離液面，

清洗管口，再蒸1分鐘后關掉熱源，否則可

能造成吸收液倒吸。二

、自動凱氏定氮法將凱氏定氮裝置組裝成具有自動操作功能的一套裝置，原理與試劑同前。自動凱氏定氮儀

：該裝置內具有

自動加堿蒸餾裝置，自動吸收和滴定裝置以及自動數字顯示裝置。消化裝置：由優質玻璃制成的凱氏消化瓶及紅外線加熱裝置組合而成的消化爐。方法特點及應用范圍·靈敏·

準確·快速·樣品用量少三

、微量凱氏定氮法·原理及適用范圍同常量凱氏定氮法。主要儀器：凱氏燒瓶(100mL);

微量凱氏定氮儀·試劑：0.01000mol/LHCl

標準液，其余同常

量法·Page

160蛋白質的快速測定一雙縮脲法·

原理方法特點及應用范圍·靈敏度較低，但操作簡單快速，在生物化

學領域中測定蛋白質含量時常用此法。·適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉

類等樣品的測定。也可定量測定分離純化

后的蛋白質。步驟。標準曲線的繪制：以采用凱氏定氮法測出蛋白

質含量的樣品作為標準蛋白質樣。按蛋白質含

量40mg

、50mg

、60mg

、70mg

、80mg

、90mg、100mg、110mg

分別稱取混合均勻的標準蛋白質

樣于8支50ml納氏比色管中，然后各加入1ml四

氯化碳，再用堿性硫酸銅溶液(①或②)準確

稀釋至50ml,振搖10分鐘，靜置1小時，取上

層清夜離心5分鐘，取離心分離后的透明液于

比色皿中，在560nm波長下以蒸餾水作參比液

調節儀器零點并測定各溶液的吸光度A,

以蛋

白質的含量為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制

標準曲線。。樣品的測定：準確稱取用品適量(使得蛋

白質含量在40～110mg之間)于50mL納氏比

色管中，加1ml四氯化碳，按上述步驟顯色

后，在相同條件下測其吸光度A。用

測

得

的

A值在標準曲線上即可查得蛋白質mg數，進

而由此求得蛋白質含量。優

點

：·

該方法比凱氏定氮法費用低，速度快(可在不到

30min

的時間內完成),是分析蛋白質最簡單的方法?！け雀Ａ址臃?、紫外吸收法或比濁法更少發生顏色

偏離?！缀鯖]有物質干擾食品中蛋白質的雙縮脲反應。不包含非多肽或非蛋白質來源的氮。缺點：。不如福林酚法靈敏，分析時至少需要2~4mg

蛋

白質。。如果存在膽汁素，則吸光度會虛假增加。。高濃度的胺鹽會干擾反應?！?/p>

不同蛋白質其最終反應產物的顏色不同，例如

明膠的雙縮脲反應產生紅紫色。。如果有高濃度的脂(用醚抽出)或碳水化合物

存在時，最終的反應溶液中可能會呈乳白色。。

此方法不是一個測量絕對值的方法，必須用已

知濃度的蛋白質(如BSA)

或經凱氏定氮法校正

。三、福

林

酚(Lowry)

法原

理。蛋白質與福林酚試劑反應，生成的藍色復合物。其中蛋白質中的肽鍵與堿性銅離子反應形成雙縮

脲反應，同時蛋白質中存在的酪氨酸和色氨酸同磷鉬酸-磷鎢酸試劑反應產生顏色，蛋白質濃度與吸光度有較好的線性關系。優點·

因為福林酚法簡單、靈敏，

已被廣泛應用于蛋

化。

，白

不用于測定未1.

非常靈敏：A:較雙縮脲法靈敏50~100倍。B:

較280nm

紫外吸收法靈敏10~20倍。C:較茚三酮法靈敏好幾倍。D:

與奈斯勒方法的靈敏度相似，但操作比其方便。2.測定結果較少受到樣品混濁度的影響。3.

特

異

性要高于其他大多數方法。4.

操作相對簡單，可以在1~1.5小時內完成。質一缺點·由于下列因素，福林酚法在某些應用中需采用標準曲線進

行校正。1.

反應產生的顏色比雙縮脲法更易因蛋白質的種類不同而發生變化。2.

反應最終的顏色深淺并不直接與蛋白質濃度成正比。3.

蔗糖、脂類、磷酸鹽緩沖液、單糖和己胺會不同程度

的

干擾反應。4.高濃度的還原糖、硫酸銨和巰基化合物會干擾反應。四、

紫

外吸

收

法原理。蛋白質在UV280nm

處有強烈吸收，這是由于蛋白質中有色氨酸和酪氨酸等芳香環殘基存在。由于存在于每一種食品的蛋白質中

色氨酸和酪氨酸的含量相當恒定，所以可

用比色法，即在280nm處比色測定蛋白質的濃度。適用范圍應用·簡便迅速，常用于生物化學研究工作，但由于許多非蛋白成分在紫外光區也有吸收作用，故還沒

有廣泛應用于食品體系。。已經用于測定牛奶和肉制品中蛋白質的含量，但

此法更適用于純化的蛋白質體系，已經抽提在堿液或變性劑(如8M尿素)中的蛋白質測定。盡管蛋白質中的肽鍵在190nm~220nm

處的紫外吸收比

在280nm

更強，但在低紫外區域的測定更困難。優點·

快速，相對較靈敏(在280mm

處需要100ug或更多的蛋白質，比雙縮脲法靈敏數倍)?！し磻皇芰蛩徜@和其它緩沖液的干擾。·

不破壞樣品原有的性質，在測定完蛋自

質含

量

后

仍

然

可

用

于

其

它

分

析

。

廣

泛

用

于

層析柱分離后的蛋白質測定。缺點·核酸在280nm

處也有紫外吸收，純蛋白質和純核酸的280nm/260n

m紫外吸收比分別為1.75和

0.5。如果知道280nm/260nm

的值，就能校正核

酸在280nm

處的吸收值。。

不同種類食品的蛋白質中，芳香族氨基酸的含

量明顯不同。。樣品溶液必須純凈無色。。此法適用于相對純凈的體系。BicinchoninicAcid(BCA)法·

原理Smith

等人提出，在堿性條件下蛋白質

將銅離子還原成亞銅離子，亞銅離子一蛋白質復合物和蘋果綠的BCA試劑反應形成淺紫色。反應形成顏色的深淺與蛋白質濃度成

正

比

。BicinchoninicAcid(BCA)法·方法。1

.

蛋白質

溶

液

和

含

有BCA

鈉

鹽

、Na,CO?、·

NaOH

、CuSO?

、

pH11.25

的BCA

試劑一步混合。。3

.

在562nm

處比色讀數，并做空白比較。

。4.用BSA作標準曲線。2.在37℃保溫30min

或室溫下放置2hr,或60℃保溫

30min

。

溫度的選擇取決于靈敏度的要求。較高的溫度導致較深的顏色反應。BicinchoninicAcid(BCA)法·

優點○

BCA

法已經應用于蛋白質的分離和純化中。此法對測定復雜食品體系中蛋白質的適用性還未見報道?！?/p>

1

.

靈

敏

度

與

福

林

酚

法

相

似

。

微

量BCA

法

的

靈

敏

度(0.5~10ug)

稍高于福林酚法?！?/p>

2.

一

步混合的操作比福林酚法更簡單。。

3.所用試劑比福林酚法簡單?！?.非離子型表面活性劑和緩沖液不對反應產生干擾。。5

.

中等濃度的變性劑(4M鹽酸胍或3M尿素)不對反應產生干擾。BicinchoninicAcid(BCA)法·

缺

點

：·1.反應產生的顏色不穩定，需要仔細地控制比色時間。

·2.還原糖會對此反應產生的干擾比對福林酚法更大?！?.不同蛋白質反應引起的顏色變化與福林酚法相似。

·4.比色的吸光度與蛋白質濃度不成線性關系。陰離子染色法原理。含蛋白質的樣品溶于緩沖液中和已知的過量陰離子

染

色

劑

混

和

，蛋白質與染色劑形成不溶性復合物。反應平衡后，離心或過濾除去不溶性的復合

物，再測定溶液中未結合的可溶性染色劑。·

蛋白質+過量染色劑

蛋白質-染色劑復合不

溶物+未結合可溶性染色劑。陰離子磺酸基染色劑，包括酸性十二號橙，橙G和

酰黑10B,

都可以和基本氨基酸殘基中的陽性基團

(組氨酸中的咪唑基、精氨酸中的胍基和賴氨酸中的

e-氨基等),以及蛋白質中游離的氨基酸終

端基團結合。。未結合的染色劑與樣品中蛋白質的含量成反比，可用分光光度計法測定。方法。1

.

樣品粉碎(60目或更小),加入過量的染色劑?！?.劇烈搖晃內容物加速染色反應至平衡，過濾或離心去除不溶物?！?/p>

3

.

測定濾液中未結合染色劑溶液的吸光度，從標準曲線

中計算染色劑濃度?！?/p>

4

.

通過對未結合染色劑濃度與樣品的蛋白質總氮含量作

圖，得到一條線性的標準曲線。

5.

與樣品同類的未知樣品的蛋白質含量可以根據標準曲

線計算，或通過最小二乘法得到的回歸方程計算。應用·陰離子染色法已經用來測定牛奶及乳制品、小

麥面粉、大豆制品和肉制品中的蛋白質。·

AOAC中共有二種染色方法(使用酸性12號橙的方法967.12和使用酰胺黑10B

的方法975.17)分析牛奶中的蛋白質。優點·

快速(10min

或更短),費用便宜，結果相對比較

準確?！ひ驗槿旧珓┎慌c不可利用的賴氨酸結合，因此可

用于測定谷物產品在加工過程可利用賴氨酸的含

量，

(

而賴氨酸是谷物產品中的限制氨基酸，所

以可利用賴氨酸含量代表谷物產品的蛋白質營養

價值。)不用腐蝕性試劑。。不需測定非蛋白氮。缺點o靈敏度低，需要毫克級的蛋白質。。蛋白質因基本氨基酸不同而具有不同的染

色容量，

因此，對于待測食品需要制作標

準曲線。。因一些非蛋白組份結合染色劑(如淀粉)

或蛋白質(如鈣或磷)而造成最后結果的

偏差。鈣和重金屬離子引起的問題可用含

有草酸的緩沖試劑來解決。考馬斯亮蘭染料比色法原理—

當考馬斯亮蘭G-250

與蛋白質相結合時，染

色劑會從紅色變成藍色，其最大吸收波長從465nm

變化至620nm,在620nm

處的吸光度與樣

品中蛋白質的濃度成正比。方法·

將考馬斯亮蘭G-250

溶解于95%酒精中，并

用85%磷酸酸化。。含有蛋白質(1~100ug/ml)

的樣品和標準BSA溶液分別與Bradford試劑混合。

·

在595nm

處讀取吸光度并扣空白。樣品中的蛋白質濃度可通過BSA

的標準曲線

來計算。應用。已經成功用于測定麥芽汁、啤酒產品和馬鈴薯塊莖中的蛋白質含量。此方法可改善測定微量蛋白質的結果。該法快速、靈敏，

且比福林酚法較少受其他因素干擾，已廣泛應用于蛋白質純化過程中的含量測定。優點·

快速，反應可在2min內完成?！?/p>

重現性好?！れ`敏度高?！げ皇荜栯x子如K+、Na+

和Mg+

等的干擾?！げ皇芰蛩徜@干擾。。不受多酚和碳水化合物干擾，如蔗糖等。。

可測定分子量大約等于或高于4000道爾頓的蛋白質。缺點·受非離子和離子型去垢劑的干擾，如三硝基甲苯

和十二烷基硫酸鈉。而由于少量的(0.

1%)去垢

劑的存在而導致的結果偏差可用適當的控制來校

正

。。蛋白質-染色劑的復合物可與石英比色皿結合，分析人員必須使用玻璃比色。反應顏色隨不同種類的蛋白質而變化，因此，必須仔細地選擇作為標準的蛋白質。比濁法·

原理·

低濃度(3~10%)的三氯乙酸、磺基水楊酸和乙

酸中的鐵氰化鉀能使提取的蛋白質沉淀形成蛋白

質顆粒的懸濁液。其濁度可由輻射光傳送過程中

的衰減而確定，輻射光傳送過程中的衰減是由于

蛋白質顆粒的散射造成的，輻射光衰減的程度與溶液中的蛋白質濃度成正比。比濁法·方法測定小麥蛋白質的常規方法為磺基水楊酸法

，

具體方法如下所述：·

1.小麥面粉用0.05N氫氧化鈉溶液萃取。·

2.溶

于

堿

液

的

蛋

白

質

從

不

溶

性

原

料

中

離

心分離。Q3.

磺基水楊酸和蛋白質溶液混合?！?/p>

4

.

在

5

4

0nm處測定其濁度，并扣去空白。5.蛋白質的含量可根據經凱氏定氮法校正過的標準曲線來計算。比濁法·

應

用。

比濁法已經用于測定小麥面粉和玉米的蛋白

質

含

量

。◎

優點：。1

.

快速，可在15min內完成?！?.測定結果不包括除了核酸外的非蛋白氮。缺點：。1.不同的蛋白質沉淀的速率不同?！?.濁度隨酸試劑濃度的不同而變化。

·

3.核酸也能被酸試劑沉淀。杜

馬

斯

法

(

燃

燒

法

)·

原理●樣品在高溫下(700~800℃)燃燒，釋放

的氮氣由帶熱導檢測器(TCD)

的氣相色

譜儀測定。測得的氮含量轉換成樣品中的

蛋白質含量。杜

馬

斯

法

(

燃

燒

法

)·方法·

樣品(大約100~500mg)稱量后置于樣

品盒中，放入具有自動裝置的燃燒反應器

中，釋放的氮氣由內置的氣相色譜儀測定。杜

馬

斯

法

(

燃

燒

法

)·

應

用·

燃燒法適用于所有種類的食品，

AOAC

方法992.15和992.23分別用于肉類和谷物食品。·

優點：o

1.

燃燒法是凱氏定氮法的一個替代方法?！?.不需要任何有害化合物。·

3

.

可

在

3min

內完成。·4.最先進的自動化儀器可在無人看管狀態下分析多達150個樣品。○

缺點：。1

.

需要的儀器價格昂貴?！?/p>

2

.

非蛋白氮也包括在內。紅外光譜法原理·

紅外光譜法測定由食品或其他物質中分子引

起的輻射吸收(近紅外，中紅外，遠紅外區)。食品中不同的功能基團吸收不同頻率的輻射。對于蛋白質和多肽，多肽鍵在中紅外波段(6.47um)

和近紅外(NIR)波

段(

如3300~3500nm,2080～2220nm,1560～1670nm)

的特征吸收可用于測定食品中的蛋白質含量。針對

所要測的成份，用紅外波長光輻射樣品，通過

測定樣品反射或透射光的能量(反比于能量的吸收)可以預測其成份的濃度。紅外光譜法·

應用·紅外牛奶分析儀采用中紅外光譜法測

定牛奶蛋白質含量，同時近紅外光譜儀

也廣泛應用于食品蛋白質的分析中(如谷物、谷類制品、

肉類和乳制品中)。

這些儀器非常昂貴，且必須經適當的調試。

但分析人員只需經最低程度的培訓就可

以快速分析樣品(30sec~2min)。氨

基

酸

的

測

定

方

法一、茚三酮比色法原理氨基酸(酰氨鍵)在堿性溶液中能與茚三酮作用，

生成藍紫色化合物(除脯氨酸外均有此反應)

,可用吸光光度法測定。該藍紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，

其最大吸收波長為570nm,故據可以測定樣品中氨

基酸含量。應用。常用來定性測定食品中蛋白質和氨基酸的存在?！ぼ崛ㄟ€沒有廣泛應用于食品中蛋白質的定量，

然而可用來測定食品加工中多肽鍵的水解和氨基酸的定量。。比較快速，但準確性較低，反應生成的顏色隨不

同的氨基酸化合物而變化。標準曲線必須針對每一個具體情況而準備。二、甲醛滴定法原理。氨基酸具有酸性的-COOI

基和堿性的-NII,基。它們相互作用而使氨基酸成為中性的內鹽。當加

入甲醛溶液時，

-NII,基與甲醛結合，從而使其堿

性消失。這樣就可以用強堿標準溶液來滴定-COOH

基，并用間接的方法測定氨基酸總量。方法特點及應用·此法簡單易行、快速方便。。在發酵工業中常用此法測定發酵液中氨基氮含量的變化，以了解可被微生物利用的氮源的量及利

用情況，并以此作為控制發酵生產的指標之一。·脯氨酸與甲醛作用時產生不穩定的化合物，使結

果偏低；酪氨酸含有酚羧基，滴定時也會消耗一

些堿而致使結果偏高；溶液中若有銨存在也可與

甲醛反應，往往使結果偏高。操作方法·吸取含氨基酸約20mg的樣品溶液于100ml容量瓶中，

加水至標線，混勻后吸取20.0ml置于200ml燒杯中，

加水60ml,開動磁力攪拌器，用0.05mol/1

氫氧化鈉標準溶液滴定至酸度計指示pH8.2,

記錄消耗氫·

(勻),。

鈉標準溶液繼續滴定至pH9.2,

記錄消耗氫氧化鈉標準溶液體積(V??)?；?。氧量氫含再用上述供計算總混V1o液，數ml甲醛溶準溶液ml10鈉入化加氧。同時取80ml蒸餾水置于另一200ml潔凈燒瓶中，先

用氫氧化鈉標準溶液調至PH8.2,

(此時不計堿消

耗量),再加入10

.

0ml中性甲醛溶液，用0.05mol/1氫氧化鈉標準溶液滴定至pH9.2,

作為

試劑空白試驗。式

中

：V?(V??-V?o)——樣品稀釋液在加入甲醛后滴定至終點

(PH9.2)

所消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，ml

;V?——

空白試驗加入甲醛后滴定至終點所消耗的氫氧

化鈉標準溶液的體積，

ml;c——

氫氧化鈉標準溶液的濃度，

mol/1;m——

測定用樣品溶液相當于樣品的質量.g;

0.014——氮的毫摩爾質量，

g/mmol。?-2)xc×0.014x100?x×20/100·

氨基酸態氨(%)=結

果

計

算說明及注意事項·也可用雙指示劑法指示終點。·此法準確快速，適用于測定食品中游離氨基酸?！す腆w樣品應先進行粉碎，準確稱樣后用水萃取，然后測定萃取液；液體試樣如醬油、飲料等可直

接吸取試樣進行測定。。若樣品顏色較深或渾濁需用電位滴定法進行測定。氨基酸的分離及測定·

薄層色譜法。氨基酸自動分析儀法。氣相色鐠法液相色譜

法薄

層

色

譜

法原理。取一定量經水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，

在溶劑系統中進行雙向上行法展開，樣品各組分在薄

層板上經過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一

物質具有相同的Rf

值，不同成分則有不同的Rf

值，因

而各種氨基酸可達到彼此分離的目的。然后用茚三酮

顯色，與標準氨基酸進行對比，即可鑒別樣品中所含

氨基酸的種類，從顯色斑點顏色的深淺可大致確定其含量。氨基酸自動分析儀法。

氨基酸的組分分析，現代廣泛的采用離子交換法，并由自動化的儀器來完成。0

乃

理

：

利

用

久

種

氪

其

酸

的

酸

堿

性

，

極

性

和

分

子

量

大

小先是導酸

酸會和導極

的每氨

，灰其提次感是

性

洗，

，堿

的；氨分基子酸量小用的茚比三酮顯色，從而定量各種氨基酸。○

定量測定的依據：

氨基酸和茚三酮反應生成藍紫色化合物的顏色深淺與各有關氨基酸的含量成正比。但脯氨酸和羥脯氨酸則生成黃棕色化合物，故需在另外波長處定量測定?！ぐ被岱治鰞x有兩種，

一種是低速型，使用300~

400目的離子交換樹脂；另一種是高速型，使用直

徑4～6um

的樹脂。不論哪一種，在分析組成蛋白

質的各種氨基酸時，都用檸檬酸緩沖液；完全分

離和定量40～46種游離氨基酸時，則使用檸檬酸

鋰緩沖液。但分析后者時，由于所用緩沖液種類

多，柱溫也要變為三個梯度，因此一般不能用低

速型。氣相色譜法原理·

將本身沒有揮發性的氨基酸轉變為適合于

氣相色鐠分析的衍生物——三氟酰基正丁

酯。它包括用正丁醇的酯化合用三氟乙酸

酐

(TFFAA)

的?；瘍筛鞑襟E。將?；?/p>

的氨基酸衍生物進行氣相色鐠分析。液相色譜法原理·蛋白質樣品經酸或堿水解后再用丹磺酰氯進行衍生化作用而溶解于流動相溶液中，

采用C8

反相柱的高壓液相色鐠儀分離并用

熒光檢測器進行測定，即可測定出各種氨

基酸的含量。方法的比較·

樣品的比較·

原理。靈敏性。速度1.

樣品的比較：·

采用凱氏定氮法和紅外光譜法則樣品幾

乎不需要多加處理，20目或更小的顆粒一般都可以滿足這些測定方法的要求，一

些更新型的NIR

儀能夠直接測定不經磨碎或其他方法處理的完整的谷物，

以及其他粗糙的顆粒產品。本章中介紹的其他方法則要求原料必須是微小的顆粒，以便于從復雜的食品體系中抽提蛋白質。2.

原理：·

杜馬斯法和凱氏定氮法直接測定食品中有

機氮元素的總量。其他方法測定蛋白質的

各種性質，例如，雙縮脲測定多肽鍵，福

林酚法測定多肽鍵、酪氨酸和色氨酸，紅

外光譜法利用樣品特別是多肽鍵經紅外波

長的光輻射時的能量吸收直接測定蛋白質

含

量

。3.

靈

敏

性

：·

凱氏定氮法、杜馬斯法、雙縮脲法和陰離子染色法的靈敏度低于紫外測定法、福林

酚法、

BCA

法或Bradford法。4.

速

度

：·

在儀器經

適

當

的

調

試

后

，紅外光譜法可能

是上述討論過的最為快速的方法。在涉及

到

比色測定的方法中，在和顯色試劑混合

前，必須把蛋白質從干擾實驗的不溶性物

質中分離出來，或者在混和后從顯色的蛋

白質-試劑復合物中除去不溶性物質，但是

比色法的測定速度還是快于凱氏定氮法。特殊的注意事項·

1

.

針對具體的應用、靈敏度、精確度、重現性以及食品的物化性質來考慮選擇適用的測定方法?！?

.

食品加工方法，如加熱可能會減弱分析時

蛋白質萃取的能力，從而在涉及萃取的步驟時

會導致蛋白質含量的測定偏低。。3.除了凱氏定氨法和紫外測定法，其他所有方

法對純化蛋白質的測定都需要使用標準或參比蛋白質，樣品中的蛋白質必須與標準蛋白質具

有相似的結構和性質特殊的注意事項·4.非蛋白氮存在于所有食品中。要測定蛋白氨，

樣品通常先要在堿性條件下萃取蛋白質，然后用

三氯醋酸或磺基水楊酸沉淀。酸的使用濃度影響沉淀得率，因此，非蛋白氮的含量隨所用試劑的

種類和濃度而變化。加熱能夠幫助酸、乙醇或其

他有機溶劑沉淀蛋白質。除了酸沉淀法用于非蛋

白質的測定外，其他較少數方法如透析、超濾和

柱色譜法也能從含少量非蛋白組分的物質中分離得到蛋白質。特殊的注意事項。5.在測定食品蛋白質的營養價值如蛋白質消化率

和蛋白質功效比

(PER)

時，凱氏定氮法采用6.25

的換算系數來計算蛋白質的含量。如果相當數量

的非蛋白氮存在于食品中，測得的PER值就可能會

偏低。如果食物樣品中的非蛋白氮含量較高(特

別是如果非蛋白氮不含許多氨基酸或者小肽),所得到的PER值可能會低于含有相似的蛋白質結

構

成份，但非蛋白氮含量較低的樣品的PER值。總結·本章介紹了基于蛋白質和氨基酸的特性來測定蛋白質的方法，其中杜馬斯法和凱氏定氮法測定氨含量，雙縮脲法和福林酚法利用銅-肽鍵的

反應來分析，紫外280nm

比色法、染色法、茚三酮法和福林酚法涉及到了氨基酸性質。BCA法利用蛋白質在堿性溶液中的還原性，紅外光譜法則基于多肽對紅外波長光輻射的吸收性質。不同方法的分析速度和靈敏度各不相同。·

不同食品體系的復雜性導致各種蛋白質分析方

法都會有一些問題。通常都要使用經選擇的蛋白質作為標準(如凱氏定氮)方法校正。第三節

蛋白質的定量測定關于氮-蛋白質換算等數6.25

二

二

6.38山5.956.25凱氏定氮法常量凱氏定氮法1.

原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。整個過程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定

消化2NH?(CH?)?COOH+13H?SO?——(NH?)2SO?+6CO?+12SO?+16H?O<1>加硫酸鉀

作為增溫劑，提高溶液沸點<2>

加

硫

酸

銅

作為催化劑、消化終點指示劑<3>

加氧化劑

加速有機物氧化速度a.

消

化

裝

置凱

氏

燒

瓶蒸餾NII?++

OH-==

NH?+H?O吸收液b.

蒸餾吸收裝置進樣漏斗玻璃珠蒸餾燒光電妒冷凝管鐵支架影響氨化完全和速度的因素·(1)K氏燒

瓶

和

取

樣

量·

(2)分解劑1g樣品

K?SO?

:H?SO?

=7g:12ml還有

一

種比例：K?S

O?:H?SO?=10g:20ml

吸收與滴定<1>用4%硼酸吸收，用鹽酸標準溶液滴定指示劑：混合指示劑(甲基紅—溴甲基酚綠)指示

劑

紅

色

一綠色

紅色(

酸

)

(

堿

)

(

酸

)反應式為：NH?+H?BO?==NH?*+H?BO?<2>用過量的H?SO?

或

HC1

標準溶液吸收，再用

NaOH

標準溶液滴定過剩的酸液。現測定某一種食品的蛋白質的含量，這種樣品含有大量的脂肪

，樣品經過處理后加入濃硫酸，為了使濃硫酸與樣品充分

結合，經振搖后大火加熱進行消化；消化

2h

后，估計消化完全，取出消化液加入少量

H

進

行

蒸

餾

，

硼

酸

(

加

入

了

指

示

劑

NaPH基紅-溴甲基酚綠)作為吸收液，最后對吸收液進行滴定。計

算C1O

〇〇◎·X

為樣品中蛋白質的含量·V?為樣品消耗鹽酸標準液的體積。V?

為試劑空白消耗鹽酸標準液的體積。C

為鹽酸標準液的濃度·Mv

為氨的摩爾質量·W

為樣品的質量·

K為氮換算為蛋白質的系數X

=二

、雙縮脲法NH?—CO—

NH

?+NH?

—CO—NH?

△150~160℃。NH?—CO—NH—CO—NH?+NH?雙縮脲雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡和物。O12345標準蛋白液/ml0.20.40.60.81.0蛋白濃度/(mg/ml)2.04.06.08.010.0蒸餾水/ml1.00.80.60.40.20.0雙縮脲試劑/mlAs404.04.04.04.04.04.0取兩組測定的Aso值的平均值，即As4o為縱坐標，蛋白質濃度為橫坐標，繪制標準曲線。操作方法。

1、制作標準曲線取10支干試管分成兩組，按下表平行操作O1樣

品

稀

釋

液

/

m

l0.5蒸

餾

水

/

m

l1.00.5雙縮脲試劑/mlAs?o4.04.02、

樣品測定取4支試管分成兩組，按下表平行操作：3、計算·取兩組測定的平均值計算：固體樣

品蛋·Y為標準曲線查得蛋白質得濃度(

mg/ml)o

N

為稀釋倍數c

為樣品原濃度(

mg/ml)

。福

林

-

酚

法(

雙