發酵法制γ-癸內酯1內容：1.γ-癸內酯1.1什么是γ-癸內酯1.2γ-癸內酯的制備方法1.3γ-癸內酯的研究現狀2.發酵法制γ-癸內酯2.1實驗原理2.2實驗材料、試劑與儀器2.3實驗過程及方法2.4實驗結果2.5數據分析與討論3.結論及感想21.γ-癸內酯31.1什么是γ-癸內酯？含有五元內酯環的十碳化合物分子量：170.25；分子式：；相對密度：0．946；折光指數n：1．452；沸點130～135℃／5mmHg；閃點158℃性質：無色～淡黃色的略微粘稠的液體，不溶于水，可溶于乙醇、油脂天然存在于桃子、草莓、椰子、芒果、杏、啤酒、朗姆酒,也存在于乳制品的風味物質中,已在120多種食物的香氣成分中發現了這種化合物γ-癸內酯具有強烈的果香和奶油香氣,稀釋時有桃子香氣41.2γ-癸內酯的制備方法：微生物發酵法：解脂假絲酵母菌化學合成方法：由烯烴作原料51.3γ-癸內酯的現狀：內酯類香料是香料家族中成員最少的一類，而且在自然界中存在很少，內酯類香料的香氣一般較為高雅，適宜調配各種香精。內酯類與酯類在香氣特征上有相似之處，即均具有突出的果香香氣，廣泛用于配制食用香精和日用香精，并用作合成香料、藥物和農藥的中間體以及聚合物和共聚物用溶劑等。62.發酵法制γ-癸內酯72.1實驗原理：蓖麻油酸甲酯合成γ-癸內酯：解脂假絲酵母菌（YarrowialipolyticaAS2.1405），對于甘油酯和烷烴類物質有很強的代謝能力，是工業上應用較為廣泛的一種菌種。蓖麻油來源豐富，且價格低廉，蓖麻油中含有的大量蓖麻油酸(順式-12-羥基-十八碳-9-烯酸)是γ-癸內酯的轉化前體，在轉化過程中R(＋)-蓖麻油酸的手性中心傳遞到γ-癸內酯上，且蓖麻油同時也可作為微生物生長的碳源，是生物法制備天然香料γ-癸內酯的理想原料。通過改進發酵工藝，控制代謝途徑等手段來提高YarrowialipolyticaAS2.1405代謝蓖麻油生物合成內酯的效率，使γ-癸內酯的發酵制備最終達到工業化生產要求，對于我國天然香料產業的發展有著巨大的推動作用。82.2實驗材料、試劑與儀器：實驗用菌株：解脂假絲酵母（yarrowialipolytica）主要實驗試劑：γ-癸內酯標準品、酵母膏、蛋白胨、磷酸二氫鉀、七水合硫酸鎂、磷酸氫二鈉、吐溫80、葡萄糖、蓖麻油主要實驗儀器：無菌操作臺、高壓鍋、氣象色譜儀、阿貝折射儀、HYG加回轉式恒溫調速藥瓶柜、離心機9實驗中所需培養基的配制：種子培養基：葡萄糖15.00g/l蛋白胨2.50g/l磷酸二氫鉀0.50g/lMgSO4.7H2O2.40g/l磷酸氫二鈉1.20g/l吐溫804.00g/l酵母膏2.50g/l發酵培養基：葡萄糖15.00g/l蛋白胨2.50g/l磷酸二氫鉀0.50g/lMgSO4.7H2O2.40g/l磷酸氫二鈉1.20g/l吐溫804.00g/l蓖麻油50.00g/l酵母膏2.50g/l102.3實驗過程及方法：Ⅰ.菌種培養：(1).配制培養基：配置菌種培養基500ml，pH調至6.5。將菌種培養基500ml分裝于三個150ml錐形瓶內，用棉花報紙封裝好，標記①②③，放置在高壓鍋內滅菌（121℃，0.1mp,20min）。將滅菌后的種子培養基置于30℃培養箱培養24h，以便查看是否滅菌完全。(2).培養過程：24h后，觀察培養基仍澄清、無渾濁現象，則未染菌，實驗可繼續進行。在無菌操作臺上接種（準備工作：先開紫外線燈進行殺菌，一段時間后，關上紫外燈進行操作），用酒精進行消毒，在酒精燈外焰無菌區以一接種環的菌量接種至每150ml種子培養基中,然后密封完全。將接種后的種子培養基培養在HYG-Ⅲ回轉式恒溫調速搖瓶柜（25℃、175r/min）中，培養24h。。1112Ⅱ.發酵培養：（1）.配制培養基：配置發酵培養基500ml，pH調制6.5。將發酵培養基500ml分裝于三個150ml錐形瓶內，用棉花報紙封裝好，標記①②③，放置在高壓鍋內滅菌（121℃，0.1mp,20min）。將滅菌后的發酵培養基置于30℃培養箱培養24h，以便查看是否滅菌完全。（2）.培養過程：24h后檢查結果，培養基表面出現白色斑狀物，說明染菌（原因是瓶口沒封好，報紙有破損）照相同配方從新做一次，條件相同。發酵培養基澄清，無渾濁現象，說明未染菌可以繼續使用。同時觀察培養了24h后的種子培養基發現溶液較渾濁，說明菌種生長較好，有一定數量的菌種產生。分別將①②③號瓶內的菌種培養基各10ml加入到對應①②③號瓶的發酵培養基中，然后放置HYG-Ⅲ回轉式恒溫調速搖瓶柜中培養48h（25℃，175r/min）。（3）.實驗結果：48小時后觀察，發酵培養基發酵完全，表面無油狀物，蓖麻油發酵完全，培養基呈乳白色，渾濁，打開后塞子后可以聞到明顯的桃香味。1314Ⅲ.γ-癸內酯的提取:(兩種提取方法)(1).低速離心、萃取(4500r/min,10min)(2).高速離心、萃取(10000r/min,10min)Ⅳ.測定方法：(1).氣象色譜檢測法:色譜柱(Agilent19091J-413HP-5),毛細管色譜柱,柱長15m,內徑0.25mm；載氣:氦氣,壓力0.5MPa；柱箱溫度采用程序升溫:40℃保持1min,以6℃/min的速度升溫至160℃,保持2min,再以8℃/min的速度升溫至230℃并保持20min;進樣口溫度為250℃;分流比10：1;進樣體積1.0μL

檢測器:氫火焰離子檢測器(FID),檢測器溫度250℃。(2).阿貝折射儀檢測：準備工作：阿貝折射儀、擦鏡紙、擦鏡液（無水乙醇∶乙醚=1∶1各20ml）、標品、樣品相同條件下分別檢測第一次離心所得液的上層油層和下層液體及第二次離心所得液的油層和下層液體的折光率，將所得數據進行比對1516172.4實驗結果：1.通過觀察最后的發酵液，聞其氣味，有很明顯的桃香味，與標品γ-癸內酯及相關文獻的描述的氣味相符，可初步判定發酵液中含有γ-癸內酯。2.氣相色譜檢測結果：檢測幾次均無結果，由于儀器陳舊，不易點火等客觀條件機器出現機械漂移，無法檢測；之后負責老師陳老師分析主要原因為學校的氣相色譜儀內的毛細管柱（5%苯基的甲基聚硅氧烷）為非極性，而我們實驗條件毛細管柱應為極性，條件不一致，因為實驗經費等客觀條件，故放棄該方案。3.阿貝折射儀檢測結果：標品折光率n1=1.4510樣品：n2=1.4510182.5數據分析與討論：經分離提純的γ-癸內酯樣品的折光率與標準品的折光率相等，可以定性檢測到產品中含有γ-癸內酯。193.結論及感想本實驗主要涉及的研究方法是酵母菌的斜面培養、發酵培養，毛細管氣相色譜條件測γ-癸內酯的含量及阿貝折射儀檢測法定性分析等方法。目前生產γ-癸內的方法有化學合成和生物合成兩種方