北DB11北京市市場監督管理局發布 1 1 1 2 2 4 5 5 6 7 8 9 I魚類貝類環境DNA識別技術規范GB/T6682分析實驗室用水規從生物生活環境中直接提取到的不同物種DNA的總和，包含動植物脫落的細胞或游離的DNA，可一種用于擴增特定DNA片段的分子生物學技術，包括變性、退火、延1般把堿基序列相似度不小于97%的OTU定義為為高通量測序時區分不同樣點來源的物種基因序列，在擴增引物5’端增加的序列特異性短片段標除非另有說明，試劑均使用符合國家標準的分析純試劑，試驗用水均使用——消毒液：次氯酸鈉和蒸餾水配制，有效氯濃度）；2）；）；）；）；）；——酚氯仿：Tris飽和酚、氯仿和異戊醇按25:2——乙酸銨（CH3COONH4）；——脫氧核糖核苷三磷酸：脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥嘌呤三磷酸、脫氧胸苷三磷酸、脫氧胞苷三），）；）；3c)水庫型水體：入庫河口區應設置采樣點，庫區每15km2~20km2設置d)河流型水體：參照SL219中水質監測斷面布設原則設置采樣斷面；對魚類eDNA樣品，在采46.2.2離岸樣點：魚類eDNA樣品在水深<10m處水面下0.5m采集，水深≥10m處分水面下0.5m和水底上1m兩個水層等比采集混合水樣；貝類eDNA樣品在水底6.2.3采樣瓶裝滿后應密封并做好標記，置于車載冰箱7.2.1連接真空泵和抽濾器，用鑷子取0.45μm孔徑的混合纖維素酯濾膜置于玻璃濾膜臺中央，蓋上c)將裂解液轉移到對應編號的新離心管中，加入等體積Tris飽e)轉移上清液到對應編號的新離心管中，5j)使用超微量紫外分光光度計檢測總DNA濃度和質量，利用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA完選擇魚類線粒體特定通用擴增引物對eDNA進行擴增。引物核苷酸下游引物R：CATAGTGGGGTATC選擇貝類線粒體特定通用擴增引物對eDNA進行擴增。引物核苷酸上游引物F：GGWACWGGWTGAACWGTW可參考附錄A中列出的8堿基條形碼參考序列進行添加，也可根據情況自行設計添加。不影響擴增PCR擴增體系包括PCR聚合酶、聚合酶緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、上下游引物、經8.1和8.2提6對PCR擴增樣品進行第二代高通量測序，利用分析軟件對測序結果數據進行預處理，去除測序過程b)去除讀長上的引物序列，去除錯配擴增序列，此步驟處理后一般僅留存35~45%的序列；e)去除由于測序讀長限制導致的末端序列不穩定的部分堿基，即序列末端的5bp~20bp；f)將前后兩端的讀長拼接成一條完整的序列，最低重疊堿基數一般設置為20bp；g)將拼接的序列進行去重復處理并排序，即刪除相同的序列，每個序列僅保留一條；i)將篩選和處理后的結果輸出fasta格式的序列文件保存。a)經篩選與處理的測序數據需使用相關生物信息學分析軟件基于97%序列相似度進行聚類，獲果界門綱目科屬種1...78b)樣品采集完成后置于4℃保存、運輸并確保在24h內完成抽濾，濾膜在a)抽濾所用器具規范滅菌和清洗，避c)DNA提取和純化所用器具按規范滅菌，耗材一次性使用，避免交叉污染。9123456789[1]HJ710.8-2014生物多樣性觀測技[3]D