禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第1頁(yè)禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第2頁(yè)試驗(yàn)一新城疫血凝與血凝抑制試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)意義：掌握血凝試驗(yàn)（HA）與血凝抑制試驗(yàn)（HAI）基本方法；體會(huì)HA與HAI在新城疫病毒及其它病毒診療和判定中應(yīng)用。基本原理：

許多病毒表面具血凝素，含有凝集一些動(dòng)物或人紅細(xì)胞特征，稱(chēng)為血凝現(xiàn)象，可用于判定病毒。血凝現(xiàn)象能夠被特異性抗體所抑制，稱(chēng)為血凝抑制現(xiàn)象，利用這種特征可進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)，稱(chēng)為血凝抑制試驗(yàn)。禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第3頁(yè)器材及試劑:待檢病毒:雞新城疫病毒雞胚尿囊液；待檢血清：抗雞新城疫病病毒陽(yáng)性血清；生理鹽水、1%雞紅細(xì)胞、96孔V形微量血凝板、加樣器等。禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第4頁(yè)（一）血凝試驗(yàn)（HA）：取96孔板，按以下步驟操作：1、第一排1-12孔各加生理鹽水50ul，第二排1-12

孔加生理鹽水50ul為紅細(xì)胞對(duì)照；2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混勻后取50ul

至第2孔，依次稀釋至第12孔，棄去50ul，各孔經(jīng)倍比稀釋后稀釋度依次為2-1~2-12。試驗(yàn)步驟禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第5頁(yè)3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%雞紅細(xì)胞50ul，微型震蕩器震蕩2min混勻。4、室溫靜置10-30分，觀察結(jié)果。5、結(jié)果判定：紅細(xì)胞對(duì)照組紅細(xì)胞完全沉降，以試驗(yàn)排中能使等量紅細(xì)胞發(fā)生完全凝集病毒最高稀釋倍數(shù)，作為病毒血凝價(jià)，即HI效價(jià)，用2n表示。禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第6頁(yè)血凝試驗(yàn)流程圖禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第7頁(yè)（二）血凝抑制試驗(yàn)（HAI）：取一96孔板，按以下步驟操作：1、4個(gè)單位抗原制備：按HA試驗(yàn)測(cè)出病毒血凝價(jià)除以4即為4個(gè)單位血凝素稀釋度。2、待檢血清稀釋?zhuān)旱谝弧⒍⑷?-12孔各加生理鹽水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待檢血清，重復(fù)吹吸3-5次混勻后，取50ul至第2孔混勻，吸收50ul至第3孔……，依次稀釋至第12孔，棄去50ul，經(jīng)倍比稀釋?zhuān)逑♂尡稊?shù)為21~212。禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第8頁(yè)3、第一、二排1-12孔各加4個(gè)單位血凝素50ul，微量震蕩器震蕩2min混勻；4、室溫靜置20min；5、第一、二、三排1-12孔各加1%雞紅細(xì)胞50ul，微量震蕩器震蕩2min混勻混勻。6、室溫靜置10-30分，觀察結(jié)果；禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第9頁(yè)7、結(jié)果判定：第二排為抗原對(duì)照，紅細(xì)胞應(yīng)全部凝集，第三排為紅細(xì)胞對(duì)照，紅細(xì)胞應(yīng)全部沉降。以待檢血清能完全抑制病毒凝集紅細(xì)胞最高稀釋倍數(shù)為血清HAI效價(jià)，用2n表示。禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第10頁(yè)血凝抑制試驗(yàn)流程禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第11頁(yè)試驗(yàn)二病毒雞胚培養(yǎng)目標(biāo)意義：

了解禽源病毒雞胚培養(yǎng)意義及用途掌握病毒雞胚培養(yǎng)基本方法基本原理：

雞胚培養(yǎng)是培養(yǎng)一些病毒慣用方法,此方法可用于一些病毒分離、增殖、毒力滴定、中和試驗(yàn)及生產(chǎn)疫苗等。病毒接種雞胚路徑有各種，主要有卵黃囊接種、絨毛尿囊腔接種、絨毛尿囊膜接種、羊膜腔接種路徑等，應(yīng)依據(jù)需要選擇適當(dāng)路徑。禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第12頁(yè)卵黃囊胚體羊膜囊絨毛尿囊腔氣室雞胚結(jié)構(gòu)模式圖禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第13頁(yè)器材及試劑:病毒：雞新城疫病毒弱毒疫苗；雞胚：9-11日齡白殼受精卵；孵卵箱、檢卵燈、鋼針、注射器、2.5%碘酒、75%乙醇、固體石蠟、眼科剪、眼科鑷等。禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第14頁(yè)試驗(yàn)步驟:1.準(zhǔn)備雞胚：接種前用檢卵燈觀察是否為受精卵及其活力。2接種（絨毛尿囊腔途經(jīng)）：（1）在檢卵燈下，用鉛筆勾出氣室及胚胎位置，并在尿囊膜血管較少地方作記號(hào)。（2）消毒：用碘酒消毒氣室蛋殼，酒精脫碘，用滅菌鋼針在記號(hào)處打一孔。禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第15頁(yè)（3）接種病毒：用18mm針頭1ml注射器吸取雞新城疫病毒，針頭經(jīng)過(guò)打出孔進(jìn)針，刺入尿囊腔，注入0.1ml。（4）用融化石蠟封閉小孔，39℃孵化器中孵化72h。禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第16頁(yè)3收獲：接種后每4小時(shí)照蛋一次，棄去24h內(nèi)死亡胚。（1）雞胚放入普通冰箱內(nèi)冷藏12h，使胎血凝固。（2）分別用碘酒和酒精消毒卵殼，用滅菌剪刀除去氣室卵殼及殼膜，撕開(kāi)下面尿囊膜。（3）將雞胚稍傾向一側(cè)，用滅菌吸管吸出尿囊液待檢。（4）觀察雞胚發(fā)育及是否有沒(méi)有病變。禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第17頁(yè)試驗(yàn)三雞白痢平板凝集試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)意義：

了解平板凝集試驗(yàn)在雞白痢診療及監(jiān)測(cè)中應(yīng)用學(xué)習(xí)雞白痢平板凝集試驗(yàn)操作方法。基本原理：

細(xì)菌等顆粒性抗原與特異性抗體結(jié)合后，在有電解質(zhì)情況下，會(huì)出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)凝集塊，稱(chēng)為凝集反應(yīng)。直接凝集反應(yīng)可分為玻片凝集與試管凝集。凝集試驗(yàn)是疾病診療及體內(nèi)抗體水平測(cè)定慣用方法。禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第18頁(yè)禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第19頁(yè)器材及試劑:抗原和血清：雞白痢凝集抗原、雞白痢標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰血清、待檢血清生理鹽水、玻片、加液槍?zhuān)?0-200ul）、接種環(huán)等。試驗(yàn)步驟:1.取一潔凈玻片，用蠟筆劃成方可格，編號(hào)2.各方格分別加被檢血清0.08、0.04、0.02、0.01ml。3.將凝集抗原搖勻，重直滴一滴于各格血清上。4.用火柴棒混勻，攤開(kāi)直徑1cm左右。禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第20頁(yè)5.靜置3-4分，再拿起玻板輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，按以下標(biāo)準(zhǔn)記反應(yīng)結(jié)果：

++++：出現(xiàn)大片凝集，液體完全透明，即100%凝集+++：有顯著凝集片和顆粒，液體幾乎完全透明，即75%凝集++：有可見(jiàn)凝集片和顆粒，液體不甚透明，即50%凝集+：僅僅能夠看見(jiàn)顆粒，液體混濁，即25%凝集-：液體均勻混濁，無(wú)凝集現(xiàn)象（同時(shí)應(yīng)設(shè)陽(yáng)性、陰性血清及抗原對(duì)照）6.結(jié)果判定：禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第21頁(yè)試驗(yàn)四雞傳染性法氏囊病瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

目標(biāo)意義：

掌握瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)操作技術(shù)體會(huì)其在雞傳染性法氏囊病診療及監(jiān)測(cè)中意義基本原理：

雞傳染性法氏囊病病毒抗原與對(duì)應(yīng)抗體在適當(dāng)電解質(zhì)存在下結(jié)合，在半固體瓊脂中擴(kuò)散,經(jīng)過(guò)一定時(shí)間形成肉眼可見(jiàn)沉淀物，據(jù)此判斷是否存在對(duì)應(yīng)抗原或抗體，作為診療雞傳染性法氏囊病依據(jù)之一。禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第22頁(yè)器材及試劑:

生理鹽水、瓊脂糖、硫柳汞、平皿、打孔器、移液器、吸頭等。試驗(yàn)步驟:1、制板:加融化1%瓊脂于潔凈玻片或培養(yǎng)皿內(nèi)，厚2.5-3.0mm。2、打孔：待瓊脂凝固后打孔，多為梅花形，普通孔徑3-4mm，孔距4-5mm。3、加樣：于中央孔加入標(biāo)準(zhǔn)沉淀抗原，周?chē)?、4孔內(nèi)加陽(yáng)性血清對(duì)照，2、3、5、6孔為待檢血清。禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第23頁(yè)4、加樣完后，將瓊脂板置于濕盒中，37℃擴(kuò)散24-48h。5、結(jié)果判定：若待檢血清與抗原孔之間出現(xiàn)白色沉淀線，則表示陽(yáng)性，若不出現(xiàn)沉淀線，為陰性。若用于檢測(cè)血清效價(jià)，則以出現(xiàn)沉淀線血清最高稀釋倍數(shù)表示（2n）。用于兩種抗原比較時(shí)，沉淀線有各種情形，應(yīng)詳細(xì)分析。禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第24頁(yè)禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第25頁(yè)制板打孔封底加樣置濕盒中擴(kuò)散瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)流程圖禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第26頁(yè)試驗(yàn)五禽霍亂診療目標(biāo)意義：

認(rèn)識(shí)禽霍亂病原巴氏桿菌兩極染色特征熟悉禽霍亂診療方法和步驟認(rèn)識(shí)病原菌分離判定在禽病診療中作用基本原理：

禽巴氏桿菌病又稱(chēng)為禽霍亂，主要表現(xiàn)為敗血癥，即實(shí)質(zhì)器官出血、腫大與壞死。巴氏桿菌在病禽組織內(nèi)呈經(jīng)典兩極著色，純培養(yǎng)物呈卵圓形或短桿狀；在血或血清瓊脂上生長(zhǎng)良好，呈露珠樣小菌落并有不一樣顏色熒光；能發(fā)酵各種糖；多殺性巴氏桿菌能致死小白鼠、家兔等。故常依據(jù)形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生化特征和動(dòng)物試驗(yàn)等來(lái)判定。禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第27頁(yè)器材及試劑:病料：患病鴨組織（肝、脾、肺）或體液（血、胸腹腔滲出液）；培養(yǎng)基：5-10%兔血瓊脂平板；動(dòng)物：小白鼠或成年健康家兔；無(wú)菌生理鹽水、吸管、注射器、針頭、酒精燈等。禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第28頁(yè)試驗(yàn)步驟:（一）形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)：病料或心血涂片，瑞氏染色。（二）培養(yǎng)特征檢驗(yàn)：將病料接種于血瓊脂平板37℃培養(yǎng)24h。（三）生化判定：禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第29頁(yè)

鴨霍亂心血涂片中多殺性巴氏桿菌禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)建議專(zhuān)家講座第30頁(yè)（四）動(dòng)物回歸試驗(yàn)：將病料剪碎并研磨，用滅菌生理鹽水制成1:10懸液，也可將血瓊