PCR技術之引物設計新教材新高考高三二輪復習

早期的干擾素是從人體白細胞中通過純化技術提取的，不僅量少，且含有很多雜質，導致作用有限。1978年，瑞士羅氏公司的科學家帕斯特卡(Pestka)成功克隆了干擾素cDNA，為后來干擾素的工業化生產奠定了基礎。1990年，基因重組技術正式應用于干擾素的工業化生產，于是今天所說的“普通干擾素”開始批量生產。如何通過基因工程生產人干擾素？1）獲取人干擾素目的基因2）構建表達載體3）將人干擾素基因導入受體細胞4）人干擾素基因的檢測與鑒定1.請說出PCR技術的原理、條件、基本過程？2.引物是什么？在復性過程中引物結合到基因的哪一端？3.PCR為什么需要引物？4.如何設計引物來特異性擴增人干擾素基因？5.如何在干擾素基因兩端添加限制酶識別序列？DNA聚合酶只能催化單個核苷酸加到已有核苷酸片段3′端的羥基上任務一：擴增干擾素基因4.如何設計引物，特異性擴增干擾素基因？干擾素基因【例1】通過PCR方法獲取干擾素基因時，TaqDNA聚合酶只能從_____________延伸DNA鏈，而不能從頭合成DNA，需要先根據_________________________

_____設計兩種特異性引物序列。擴增干擾素基因所需2種引物的序列為（寫出引物的前6個堿基）

。引物的3′端

目的基因(干擾素基因)兩端堿基序列提示：引物與3

′端DNA鏈結合，

與5

′端DNA鏈序列相同5′--CCTAGA--3′3′--TTGAAA--5′5′-CCTAGA-3′；5′-AAAGTT-3′（3）若下表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是_______。【例2】[2020·江蘇·33]如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側的未知序列，具體流程如下圖（以EcoRI酶切為例）：3’5’3’5’②④提示：由待擴增區段倒推所需引物5.如何在干擾素基因兩端添加限制酶識別序列？---加在引物5

′端5.如何在干擾素基因兩端添加限制酶識別序列？【例3】為使目的基因與載體正確連接，

在設計PCR引物時可添加限制酶

______________的識別序列。已知干擾素基因左端①處的堿基序列為-CCTAGAT-，則其中一種引物設計的序列是

5

3’。XhoⅠ和MunⅠ-CTCGAGCCTAGAT---XhoⅠ-CCTAGAT----加在引物5

′端3

′端提示：1.引物5′端加哪種限制酶2.基因左端引物與哪條鏈結合載體目的基因自連片段間的連接正向連接反向連接1.怎樣設計引物檢測干擾素基因是否正向連接？---同時擴增載體和目的基因【例4】[2023·山東·25]科研人員構建了可表達J-V5融合蛋白的重組質粒并進行了檢測，該質粒的部分結構如圖甲所示，其中V5編碼序列表達標簽短肽V5。（2）構建重組質粒后，為了確定J基因連接到質粒中且插入方向正確，需進行PCR檢測，若僅用一對引物，應選擇圖甲中的引物___________________。已知J基因轉錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的_________（填“a鏈”或“b鏈”）相應部分的序列相同。F1和R2

或F2和R1

a鏈

3

′端提示：引物位置只代表延伸方向解題關鍵：判斷模板鏈方向。任務二：檢測干擾素重組載體

檢測發現，轉入的干擾素基因在大腸桿菌細胞中表達效率很低，且不易體外保存，如何生產大量表達、易保存、可口服的人干擾素呢？

資料一：不同生物對密碼子具有不同的偏好。同樣編碼甲硫氨酸，原核生物偏好的GUG，真核生物偏好的AUG；

資料二：科學家對比人白細胞表達的天然干擾素結構圖和失活人工干擾素結構圖，推測將干擾素第17位的半胱氨酸替換成絲氨酸，可使干擾素結構穩定，且不影響功能；

資料三：提出將人干擾素基因和CTB蛋白基因融合作為目的基因，便可利用CTB蛋白能防止外源蛋白在小腸黏膜處被消化分解的特性實現人干擾素口服制劑的生產；

1.如何誘導干擾素基因在特定位點突變？2.如何在干擾素基因的一端引入突變位點？3.如何在干擾素基因的內部引入突變位點？4.如何通過PCR技術，構建融合基因？5.如何修飾引物確保表達出正確的干擾素氨基酸序列？【例5】[2021·天津·16](1)獲得轉基因釀酒酵母菌株的過程如下設計引物擴增乳酸脫氫酶編碼序列。為使擴增出的序列中編碼起始密碼子的序列由原核生物偏好的GTG轉變為真核生物偏好的ATG,且能通過雙酶切以正確方向插人質粒,需設計引物1和2。其中引物1的5'端序列應考慮：

和

。包含BamH的識別序列

2.如何誘導干擾素基因的兩端位點突變？將GTG改為ATG【例6】PCR技術不僅可以擴增目的基因，還可用于定點誘變目的基因等。大引物PCR就是一種定點突變技術。大引物PCR需要用到引物進行兩次PCR，其操作步驟如圖∶

在第一次PCR反應中，形成圖示雙鏈DNA至少要經過_____次復制。第一次PCR產物DNA的_____條鏈作為第二次PCR所用的引物。與X射線誘變相比，該突變技術的優點是____________________________________。1目的性強、突變概率高Ca2(3)利用微生物進一步克隆PCR定點誘變產物作為目的基因，將獲取目的基因和質粒進行連接后，需先用_____處理農桿菌以便將基因表達載體導入馬鈴薯細胞，將馬鈴薯細胞培養成幼苗時經過的兩個過程是_____。【答案】(1)3耐高溫的DNA聚合酶(2)(3)目的基因與載體結合

將重組DNA導入受體細胞

+

脫分化和再分化23.如何誘導干擾素基因的中間位點突變？---①大引物PCR思考：第一次PCR與第二次PCR的復性溫度比較3.如何誘導干擾素基因的中間位點突變？---②重疊延伸PCR【例7】重疊延伸PCR需要用到引物進行4次PCR，其操作步驟如圖。圖中所示的4次PCR如何選擇引物？請填寫以下表格（若選用該引物劃“√”，若不選用該引物則劃“×”）。

引物A引物B引物C引物DPCR1

PCR2

PCR3

PCR4

√√√√√√××××××××××abcd4.如何通過PCR技術，構建融合基因？3’3’5’5’---②重疊延伸PCR【例8】[2022·山東·25]PCR擴增得到的P基因經酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個融合基因，如圖甲所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導入細胞后，融合基因轉錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因對應的氨基酸序列與P不同。據圖甲分析，出現該問題的原因是______。修改擴增P基因時使用的帶有EcoRⅠ識別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是______5.如何修飾引物確保表達出正確的干擾素氨基酸序列？1.P基因編碼鏈的第一個堿基與EcoRI識別序列的最后兩個堿基編碼一個氨基酸，導致mRNA的密碼子被錯位讀取

2.在引物中的EcoRI識別序列3'端添加1個堿基提示：其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導入細胞后，融合基因轉錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因對應的氨基酸序列與P不同，出現該問題的原因是：P基因編碼鏈的第一個堿基與EcoRI識別序列的最后兩個堿基編碼一個氨基酸，導致mRNA的密碼子被錯位讀取

在引物中的EcoRI識別序列3'端添加1個堿基修改擴增P基因時使用的帶有EcoRⅠ識別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是:PCR應用引物設計要點總結1.擴增目的基因干擾素基因正向連接的重組載體融合基因A+B???????根據目的基因兩端堿基序列設計引物①引物與目的基因3

′端鏈結合，與5

′端序列相同2.改造目的基因加限制酶識別序列定點突變防止移碼突變???????歸納總結②-P,-OH；啟動子；模板鏈；編碼鏈；起始密碼子等1.[2019·江蘇·33]圖1是某基因工程中構建重組質粒的過程示意圖，載體質粒P0具有四環素抗性基因（tetr)和氨芐青霉素抗性基因（ampr）。請回答下列問題：

（4）為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質粒，擬設計引物進行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質粒中的相應位置，PCR鑒定時應選擇的一對引物是__________。某學生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質粒中擴增出了400bp片段，原因是________________________。目的基因反向連接乙、丙乙正向連接

反向連接2.PCR技術的發明可以說是生物學的分水嶺，該技術對于目的基因的定點誘變也是非常重要的，目的基因的不同位置突變需求往往可以采用不同的策略。結合所學知識回答以下問題:（1）若突變堿基位于目的基因某一側，可以采用如圖1所示的大引物PCR技術，在圖1獲取突變基因過程中，需要以下3種引物:引物A:5'-CCCCAACCGGAAAGTGTCA-3'(下劃線字母為突變堿基)引物B:5'-TAAGCTTCGAACATCCTA-3'(下劃線部分為限制酶HindⅢ識別序列)引物C:5'-GTGAGCTCGCTGCCCCAA-3'(下劃線部分為限制酶SacI識別序列)則PCR1中使用的引物有

，PCR2中使用的引物有

和圖中大引物的

(選填①或②)鏈。引物A和引物C引物B②(2)若突變堿基位于目的基因中央時，可以采用如圖2所示的PCR技術，圖2中4次PCR對引物的使用不完全相同，如PCR1選擇引物A和B，PCR2選擇引物C和D，請問PCR3和PCR4應分別如何選擇引物，____________________________