關于細胞培養相關技術體外培養細胞的特性

培養細胞的生長方式貼附生長：必須貼附于支持物表面才能生長，如各種實體瘤細胞。懸浮生長：于懸浮狀態下即可生長，不需要貼附于支持物表面，如各種造血系統腫瘤細胞。細胞培養：模擬體內的生理環境，在無菌、適溫和豐富的營養條件下，使離體細胞生存、生長并維持結構和功能的一門技術。第2頁,共61頁，2024年2月25日，星期天基本概念原代培養

動物或人組織直接用蛋白酶消化所得的細胞經體外培養后可貼壁或懸浮生長，在傳代之前稱為原代培養。傳代細胞在培養器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養器皿中。細胞系

cellline原代培養物成功傳代后，則稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限，則稱之為有限細胞系（finitecellline）；已獲無限繁殖能力能持續生存的細胞系，稱連續細胞系或無限細胞系（infinitecellline）。無限細胞系大多已發生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細胞，因此本質上已是發生轉化的細胞系。細胞株

cellstrain從一個經過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株。通常將具有特殊性質或標志物的細胞群稱為細胞株。第3頁,共61頁，2024年2月25日，星期天美國標準細胞庫或細胞銀行（ATCC）和人遺傳突變細胞庫（HGMR）、細胞衰老細胞庫（CAR）等ATCC不僅是美國，也是世界最大的細胞庫，是世界衛生組織WHO的國際培養細胞文獻中心ATCC現液氮凍存有3200個已經過鑒定的細胞系，接納來自世界各國已經鑒定的細胞予以貯存，同時也向世界各國的研究者或實驗室免費提供研究用細胞（做盈利性研究時收費）武漢大學細胞典藏物中心細胞典藏物中心第4頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

每代貼附生長細胞的生長過程游離期貼壁期潛伏期對數生長期停止期（平臺期）第5頁,共61頁，2024年2月25日，星期天游離期：細胞接種后在培養液中呈懸浮狀態．也稱懸浮期。此時細胞質回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時第6頁,共61頁，2024年2月25日，星期天貼壁期：細胞附著于底物上，游離期結束。細胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進口塑料培養瓶涂有生長基質（化學合成的功能基團）第7頁,共61頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共61頁，2024年2月25日，星期天潛伏期此時細胞有生長活動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為6～24小時。第9頁,共61頁，2024年2月25日，星期天對數生長期：細胞數隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。第10頁,共61頁，2024年2月25日，星期天停止期（平臺期）：細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂機制：接觸抑制、密度依賴性第11頁,共61頁，2024年2月25日，星期天細胞培養方式

群體培養（massculture），將含有一定數量細胞的懸液置于培養瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合后形成均勻的單細胞層克隆培養（clonalculture），將高度稀釋的游離細胞懸液加入培養瓶中，各個細胞貼壁后，彼此距離較遠，經過生長增殖每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克隆（clone）。一個細胞克隆中的所有細胞均來源于同一個祖先細胞。

第12頁,共61頁，2024年2月25日，星期天群體培養（左）和克隆培養（右）

第13頁,共61頁，2024年2月25日，星期天培養細胞生長的條件無污染環境:生物安全柜，超凈工作臺基質:玻璃，塑料…營養需要:氨基酸，碳水化合物，無機鹽，緩沖系統，維生素…(商業化合成培養基)

pH:7.2-7.4溫度:37℃，細胞培養箱氣體環境

O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-第14頁,共61頁，2024年2月25日，星期天實驗準備實驗用品：超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸，紫外燈，甲醛熏蒸器CO2培養箱倒置顯微鏡酶標儀、微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養瓶，吸管，電動移液器，培養板，凍存管。。。第15頁,共61頁，2024年2月25日，星期天CO2培養箱CO2培養箱設定的條件為37℃，5％CO2

。使用CO2培養箱培養細胞時應注意的問題：①用螺旋口瓶培養細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養箱內空氣干凈。定期消毒（90℃，14h或者紫外殺菌)。③箱內置4-6L蒸餾水，加入100ml飽和硫酸銅溶液，以保持箱內濕度，避兔培養液蒸發，并抑制真菌污染。第16頁,共61頁，2024年2月25日，星期天實驗物品準備

常用玻璃器皿清洗浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、泡酸（24小時）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50℃烘干第17頁,共61頁，2024年2月25日，星期天清潔液的配制第18頁,共61頁，2024年2月25日，星期天細胞培養用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20

加水至1000ml第19頁,共61頁，2024年2月25日，星期天消化液胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。

胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。用含血清培養液終止其對細胞的消化作用第20頁,共61頁，2024年2月25日，星期天培養基培養基（培養液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養基和合成培養基。合成培養基：根據細胞生存所需物質的種類和數量，用人工方法模擬合成的。目前已設計出許多種培養基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。人工合成培養基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養基（如血清）。第21頁,共61頁，2024年2月25日，星期天血清中含有：多種蛋白質（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子激素促貼附物質，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等各種生長因子轉移蛋白不明成分一般說來，含5％小牛血清的培養基對大多數細胞可以維持細胞不死，但支持細胞生長一般需加10％血清。第22頁,共61頁，2024年2月25日，星期天常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質量最好。優質血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過濾除菌第23頁,共61頁，2024年2月25日，星期天抗生素的使用在培養液配制后，培養液內常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯合使用。培養基內青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩定第24頁,共61頁，2024年2月25日，星期天完全培養基的組成基礎培養基80％一95％血清5％一20％碳酸氫鈉2.0g/L青、鏈霉素各100單位／毫升第25頁,共61頁，2024年2月25日，星期天細胞培養基本方法（無菌原則）無菌工作臺用75%酒精擦拭干凈，紫外線照射40分鐘以上。清洗雙手及手腕，戴乳膠手套，然后用75%酒精擦拭。操作時注意無菌臺內空間層次。整個操作過程盡量在無菌臺靠里面一點。手及物品不要在暴露的瓶口上方來往，嚴格注意無菌操作。第26頁,共61頁，2024年2月25日，星期天細胞傳代方法根據細胞生長的特點，傳代方法有3種。懸浮生長細胞傳代離心法傳代：離心（1000轉/分）去上清，沉淀物加新培養液后再混勻傳代。半懸浮生長細胞傳代此類細胞部分呈現貼壁生長現象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。貼壁生長細胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。第27頁,共61頁，2024年2月25日，星期天貼壁生長細胞傳代方法吸光培養瓶中的培養液適量PBS洗凈殘留培養液加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準）靜置2-10min（顯微鏡下動態監測）加入培養液，終止胰酶消化作用用吸管吸取瓶內培養液，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液吸取1/3細胞懸液，接種于新的培養瓶內加適量新鮮培養液于接種了細胞懸液的新培養瓶內將后者放入培養箱中培養第28頁,共61頁，2024年2月25日，星期天細胞凍存和復蘇細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少入力、經費，減少污染，減少細胞生物學特性變化。第29頁,共61頁，2024年2月25日，星期天

凍存和復蘇的原則：慢凍快融當細胞冷到零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。

如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶；相反．結晶就大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。第30頁,共61頁，2024年2月25日，星期天慢凍程序標準程序：當溫度在-25℃以上時，1～2℃/min

當溫度達-25℃以下時，5～10℃/min

當溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中細胞凍存器簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2℃的速度，在40分鐘內降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。第31頁,共61頁，2024年2月25日，星期天低溫保護劑的應用在細胞凍存時加入低溫保護劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高細胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在細胞外形成冰晶，減少細胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。第32頁,共61頁，2024年2月25日，星期天細胞凍存方法預先配制凍存液：含20%血清培養基

10%DMSO取對數生長期細胞，經胰酶消化后，加入適量凍存液，用吸管吹打制成細胞懸液（1×106～5×106細胞/ml)加入1ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期第33頁,共61頁，2024年2月25日，星期天細胞復蘇方法從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。5分鐘內用培養液稀釋至原體積的10倍以上。低速離心10分鐘。去上清，加新鮮培養液培養剛復蘇的細胞。第34頁,共61頁，2024年2月25日，星期天細胞計數血細胞計數板計數儀Counter第35頁,共61頁，2024年2月25日，星期天血球計數盤一般有二個chambers，每個chamber

中細刻9

個1

mm2大正方形，其中4

個角落之正方形再細刻16

個小格，深度均為0.1

mm。當chamber

上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1

mm2

x

0.1

mm=1.0

x

10-4

ml。使用時，計數每個大正方形內之細胞數目，乘以稀釋倍數，再乘以104，即為每ml

中之細胞數目。

第36頁,共61頁，2024年2月25日，星期天培養細胞活力測定臺盼藍法，trypan

blue，

利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。用活細胞占細胞中的百分比表示細胞活力MTT法第37頁,共61頁，2024年2月25日，星期天轉染(Transfection)將具生物功能的核酸轉移或運送到細胞內并使核酸在細胞內維持其生物功能常特指將質粒或以它們為載體構建的重組子導入真核細胞的過程。

第38頁,共61頁，2024年2月25日，星期天轉染和轉化的區別轉化特指將質粒DNA或以其為載體構建的重組DNA導入細菌體內，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。第39頁,共61頁，2024年2月25日，星期天瞬時轉染和穩定轉染瞬時轉染，外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數，產生高水平的表達，但通常只持續幾天。一般來說，在轉染后24-96小時內檢測和分析結果。穩定轉染，也稱永久轉染，外源DNA整合到宿主染色體中。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉染細胞能整合，通常需要通過選擇性標記篩選，如抗生素篩選APH（新霉素抗性基因），HPH（潮霉素），TK（胸苷激酶）等反復篩選，得到穩定轉染的同源細胞系。第40頁,共61頁，2024年2月25日，星期天影響轉染效率的因素細胞培養物健康的細胞低的細胞代數（<50）能確保基因型不變一定的細胞密度推薦在轉染前24小時內分細胞，這將提供正常細胞代謝，增加對外源DNA攝入的可能第41頁,共61頁，2024年2月25日，星期天血清血清是一種包含生長因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對不同細胞的生長作用有很大的差別。血清質量的變化直接影響轉染效率。有些轉染技術如脂質體轉染在有血清存在情況下效率很低，因此在轉染前要除血清。第42頁,共61頁，2024年2月25日，星期天DNA質量一般的轉染技術（如脂質體等）基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子、蛋白、代謝物污染都會顯著影響轉染復合物的有效形成及轉染的進行。核酸純化世界第一品牌德國QIAGEN公司提供的超純質粒抽提試劑盒，能達到兩倍2xCsCl梯度離心以上的純度效果，使DNA質量得到保證。對一些內毒素敏感的細胞（如原代細胞，懸浮細胞和造血細胞），QIAGEN還提供可去除內毒素污染的質粒抽提試劑盒，在質粒抽提過程中有效去除脂多糖分子，保證理想的轉染效果。第43頁,共61頁，2024年2月25日，星期天6孔板轉染實驗步驟轉染前18至24小時內接種2×105細胞至每孔內（細胞濃度1×105/ml，每孔接種2ml，全培養基培養，無抗生素），轉染前4小時更換培養基對每孔細胞，稀釋2ugDNA于250ulOptiMEM對每孔細胞，稀釋4ulLipofectamine2000于250ulOptiMEM，室溫孵育5min將步驟2和步驟3中的DNA懸液和Lipofectamine2000懸液均勻混勻，室溫孵育20min以使DNA-Lipofectamine2000復合物形成將DNA-Lipofectamine2000complexes(500ul)直接輕柔的滴加到每孔細胞中，輕柔搖勻第44頁,共61頁，2024年2月25日，星期天免疫熒光染色IF免疫熒光組織（細胞）化學技術，是采用熒光素標記的已知抗體

（或抗原）作為探針，檢測待測組織、細胞標本中的靶抗原（或抗體），形成的抗原抗體復合物上帶有熒光素，在熒光顯微鏡下，由于受紫外光照射，熒光素發出明亮的熒光，這樣就可以分辨出抗原（或抗體）的所在位置及其性質。

第45頁,共61頁，2024年2月25日，星期天直接法：將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。其優點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。間接法：特異性的一抗和熒光素標記的二抗第46頁,共61頁，2024年2月25日，星期天F-actin直接染色中文名稱：鬼筆環肽英文名稱：phalloidin定義：由鬼筆鵝膏真菌（Amanitaphalloides）產生的一種環肽。可與F肌動蛋白結合，使F肌動蛋白保持穩定。其熒光標記物是鑒定F肌動蛋白的重要試劑。

第47頁,共61頁，2024年2月25日，星期天GFPTRITC-phalloidinDAPI07.23.1058,60,6162,64,6580,81,82第48頁,共61頁，2024年2月25日，星期天間接免疫熒光染色制片細胞接種固定破膜封閉染色封片和熒光顯微鏡觀察第49頁,共61頁，2024年2月25日，星期天制片Chamberslide：腔室玻璃系統Coverslip：蓋玻片（酒精，紫外照射滅菌）玻片包被：膠原，纖維蛋白fibronectin，整合素intergrin，vitronectin…

*有些基質蛋白是與細胞內某些信號通路相關的Chamberslide第50頁,共61頁，2024年2月25日，星期天細胞接種根據不同的研究內容和實驗目的，選擇不同細胞密度進行接種和生長時間染色前用溫熱的PBS洗去培養基（含Ca2+、Mg2+

或者不含Ca2+、Mg2+的PBS的選擇）第51頁,共61頁，2024年2月25日，星期天固定根據需要選擇適當的固定劑固定細胞，如4%多聚甲醛固定15分鐘多聚甲醛宜現用現配，或配好后分裝-20℃凍存，用之前37℃復溫固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月PBS洗滌3×5min第52頁,共61頁，2024年2月25日，星期天破膜或通透在檢測細胞內抗原表位的時候需要對細胞進行通透處理，因為抗體需要進入細胞內部去檢測蛋白如果待檢測的是跨膜蛋白，且其抗原表位處于胞質內區域，則同樣需要對細胞進行通透如果所檢測的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，則不需要進行通透。常用的通透劑是去垢劑，如Triton，NP-40，以及Tween20，Saponin，Digitonin和Leucoperm等。Triton和NP-40屬于烈性去垢劑，可部分溶解細胞核膜，因此非常適合核抗原檢測。但應該注意的