1DB53/T447.5—2022云嶺牛第5部分：體外胚胎生產本文件規定了云嶺牛供體的選擇與飼養管理、卵母細胞的獲取、卵母細胞的檢出與分級、卵母細胞的IVM、卵母細胞的IVF、受精卵的IVC等技術要求。本文件適用于牛體外胚胎生產和移植技術操作。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。DB53/T447云嶺牛第4部分：胚胎移植3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1活體采卵ovumpickup借助超聲波探測器或內窺鏡，直接從供體牛活體卵巢中采集（吸取）未成熟的卵母細胞。3.2體外受精invitrofertilization在體外培養條件下完成卵母細胞的成熟、受精、以及受精卵發育成可移植胚胎。其過程包括卵母細胞的體外成熟（Invitromaturation，IVM）、體外受精（Invitrofertilization，IVF）和受精卵的體外發育培養（Invitroculture，IVC）。3.3體外胚胎生產invitroembryoproduction以IVM、IVF和IVC連續步驟生產胚胎的過程，稱為體外胚胎生產（Invitroembryoproduction，IVP）。4設施、儀器及器具、耗材4.1主要設施胚胎工程實驗室、采卵室、分牛欄、保定架等。4.2主要儀器超凈工作臺、超純水儀、高壓滅菌儀、干熱滅菌儀、EO滅菌儀、超低溫冰箱、電冰箱、電子天平、倒置顯微鏡、實體顯微鏡、CO2培養箱、活體采卵裝置、胚胎冷凍儀、恒溫臺、水浴鍋、細胞(胚胎)培養運輸儀、液氮罐、pH測定儀、封口機等。4.3主要器具、耗材2DB53/T447.5—2022硅化瓶、燒杯、量筒、過濾滅菌濾器（0.22μum，0.45μm）、酒精燈、離心管（10mL或15mL、50mL）、培養皿、注射器（1mL、5mL、10mL、20mL、50mL）、檢卵器或微細玻璃管、巴氏玻璃管、記號筆、計時器；過濾式集卵（胚）杯、手術器具一套（毛剪、止血鉗、鑷子等）、塑料細管專用剪、塑料細管（0.25mL）、胚胎解凍杯和溫度計、胚胎移植槍、移植槍加外套和保護膜、75%酒精棉球等。5供體牛的選擇與飼養管理供體牛的選擇參照DB53/T447.4的規定執行。供體牛的飼養管理參照DB53/T447.4的規定執行。6卵母細胞的獲取6.1獲取方式從活體供體牛卵巢中采集（活體采卵）或從屠宰后母牛離體卵巢中采集卵母細胞。6.2活體采卵（OPU）6.2.1采卵前的準備6.2.1.1裝置和器具B型超聲波掃描儀、扇形陰道探頭（7.5MHz）、真空泵和恒溫器；16G、17G、18G金屬采卵針、回收管、50mL離心管（集收杯）、一次性注射器（5mL、10mL）等。6.2.1.2麻醉劑2%利多卡因或普魯卡因。6.2.1.3采卵液D-PBS+10IU/mL肝素鈉+1%FCS+青霉素100IU/mL+100μg/mL鏈霉素。6.2.1.4采卵裝置的調試將采卵裝置按要求安裝好，并調試到正常工作狀態，同時把采卵液及其它必需物品在專用臺車或工作臺上擺放好。6.2.1.5供體牛的保定與麻醉按DB53/T447.4的規定執行。6.2.2采卵按以下步驟采卵：a)用右手將B超探頭輕緩地插入母牛陰道子宮頸一側的穹隆處，并把握好；b)左手插入直腸，用手隔著直腸壁找到卵巢，并將其貼近探頭面上，通過B超顯示屏觀察卵巢是否正常，記錄卵泡的數目及其大小；c)將吸滿采卵液的單腔采卵針插入裝在探頭上的采卵針筒中；d)用直腸中的左手移動卵巢使穿刺目標卵泡位于B超顯示屏中顯示的采卵線上，根據B超顯示屏上所顯示的目標卵泡位置，用把握探頭的右手手指推動進針管進行穿刺（針頭刺穿陰道壁3DB53/T447.5—2022和卵泡壁）的同時踩下腳踏開關將卵母細胞及卵泡液一同吸到置于恒溫器中收集管內（37。C恒溫）；e)穿刺目標卵泡為直徑2mm～8mm；f)吸卵時真空泵壓力80mmHg～85mmHg。6.2.3采卵頻率根據實際需要可采用每周1次～2次、每月一次或在母牛集中配種前隨機選擇，批量采卵。6.3從屠宰后母牛離體卵巢中采集卵母細胞6.3.1主要材料保溫箱（壺）、止血鉗、手術剪、乳膠手套、注射器、針頭、離心管、注射器用滅菌過濾器（0.25μm）等。6.3.2卵巢保存液滅菌的PBS液或生理鹽水+100mg硫酸卡那霉素。6.3.3卵巢的收集母牛屠宰后30min內采集卵巢，用卵巢保存液沖洗2次～3次后放入盛有33。C保存液的保溫瓶內保存，盡快帶回實驗室。6.3.4卵母細胞的吸取按以下步驟進行卵母細胞的吸取：a)以PBS液100mL+青霉素100萬單位、鏈霉素10mg，過濾滅菌配置采卵液，裝瓶后放入33。C的恒溫槽內待用；b)清理卵巢上粘著的脂肪等組織，用保存液沖洗2次～3次，放入加有卵母細胞清洗液（含量0.3%BSA的BO液（見9.1.1）的燒杯后暫置入33。C恒溫槽內；c)用帶18G或20G針頭的10mL注射器吸取2mm～8mm卵泡的卵泡液，注入到15mL或50mL離心管內置于恒溫槽待檢卵和分類。7卵母細胞的檢出與分級7.1卵母細胞的檢出按以下步驟檢出卵母細胞：a)收集到的卵泡液倒入胚胎濾杯中，用含5%～10%CS或FCS的PBS液的洗卵液稀釋，洗滌3次~4次，將濾杯中的液體及沉淀物倒入培養皿中；b)在實體顯微鏡下檢出卵母細胞，如使用帶有側濾網的胚胎濾杯，則可直接在其中檢卵；c)收集卵質色澤基本均勻、卵母細胞周圍有1層～數層卵丘的卵丘-卵母細胞復合體（Cumulusoocytecomplexes,COCs）放入盛有PBS液的培養皿中。7.2卵母細胞的分級與選用7.2.1卵母細胞質色澤均勻，卵母細胞周圍包圍≥4層卵丘細胞，卵丘-卵母細胞復合體（Thecumulusoocytescomplexes，COCs）完整為Ⅰ級。4DB53/T447.5—20227.2.2卵母細胞質色澤均勻、卵母細胞周圍包圍3層卵丘細胞，COCs完整為Ⅱ級。7.2.3卵母細胞質色澤基本均勻、卵母細胞周圍包圍1～2層卵丘細胞，COCs基本完整為Ⅲ級。7.2.4卵母細胞質色澤基本均勻，卵丘細胞擴散或半裸、裸卵和閉鎖卵為Ⅳ級。7.2.5選擇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級卵母細胞用于體外成熟培養。8卵母細胞的體外成熟培養（IVM）8.1體外成熟培養液的配制TCM-199（19mL）+CS或FCS1mL+FSH20μl（0.1μg/mL）或E21μg/mL+抗菌素20μl（青霉素10萬IU/mL、鏈霉素100mg/mL），過濾滅菌后備用。8.2COCs的清洗與體外成熟培養（IVM）按以下步驟進行COCs的清洗與體外成熟培養（IVM）：a)用IVM培養液在35mm培養皿中制成100μl微滴3個～4個或放入4孔培養皿中，覆蓋石蠟油，在CO2培養箱中平衡20min；b)COCs用IVM液洗滌3次，移入經平衡的培養微滴中（每滴15枚～20枚），在5%CO2、95%空氣、38.5。C、飽和濕度的培養箱中培養22h。9卵母細胞的體外受精（IVF）9.1精子的制備與獲能處理9.1.1BO液的配制（修正）9.1.1.1BO液的配制（修正）應由A液和B液組成。9.1.1.2A液：NaCl4.3092g+KCl0.1974g+CaCl20.2171g+NaH2PO40.0840g+MgCl20.0697g+0.5%酚紅0.1mL+超純凈水500mL。9.1.1.3B液：NaHCO32.5873g+0.5%酚紅0.04mL+超純凈水200mL，溶解后CO2氣體通氣30min作氣相平衡。9.1.1.4A液76mL+B液24mL+丙酮酸鈉0.1375g+抗菌素100μl（青霉素10萬IU/mL，鏈霉素100mg/mL）+肝素鈉130μl，過濾滅菌后冷藏保存。9.1.2精子清洗液配制BO液50mL+咖啡因10mmol/L，過濾滅菌。9.1.3精子稀釋液配制BO液10mL+BSA（牛血清白蛋白）0.06g，過濾滅菌。9.1.4精子制備與獲能按以下步驟進行精子制備與獲能：離心5min；b)吸棄上清液，留1mL～2mL，同法第二次離心洗滌，留1mL，加1mL精子稀釋液，使稀釋后的精子數達(5106)個/mL；5DB53/T447.5—2022c)取95μl精子稀釋液注入到5μl卵母細胞清洗液微滴中，使之成為100μl的精子培養微滴，覆蓋石蠟油；d)在5%CO2、95%空氣、38.5。C、飽和濕度的培養箱內預培養1h～1.5h。9.2卵母細胞的體外受精（IVF）IVM22h的COCs用卵母細胞清洗液洗滌3次，放入已準備好的100μl精子培養液微滴中（每滴15枚~20枚），在5%CO2、95%空氣、38.5。C、飽和濕度的培養箱內受精5h。10受精卵的體外發育培養（IVC）10.1IVC培養液（m-CR1aa）的配制NaCl0.67g+KCl0.023g+NaHCO30.22g+半乳酸鈣0.055g+丙酮酸鈉0.004g+谷氨酰胺0.015g+酚紅0.0005g+必需氨基酸1mL+非必需氨基酸1mL+超純凈水100mL+抗菌素100μl（青霉素10萬IU/mL，鏈霉素100mg/mL），過濾滅菌，分裝待用。10.2受精卵的清洗和體外發育培養按以下步驟進行受精卵的清洗和體外發育培養：a)取m-CR1aa培養液放入35mm培養皿或4孔培養皿中，覆蓋石蠟油在培養箱中平衡1h；b)受精后的卵母細胞用5%CS的m-CR1aa培養液清洗3次；c)不作裸化處理，保留1層～2層卵丘細胞，移到預先盛有m-CR1aa培養液的100