關于色層分離法生物分離工程色層技術（層析技術）色層法是目前廣泛應用的一種分離技術，本世紀初俄國植物學家M.Tswett發現并使用這一技術證明了植物的葉子中不僅有葉綠素還含有其它色素。現在色層法已成為生物工程、生物化學、分子生物學及其它學科領域有效的分離分析工具之一。第2頁,共97頁，2024年2月25日，星期天色層分離方法－Chromatography

色層分離法是一組相關分離方法的總稱，它的機理是多種多樣的，但不管哪種方法都必須包括兩個相。一相是固定相，通常為表面積很大的或多孔性固體；另一相是流動相，是液體或氣體。當流動相流過固定相時，由于物質在兩相間的分配情況不同，經過多次差別分配而達到分離，或者說，易分配于固定相的物質移動速度慢，易分配于流動相中的物質移動速度快，因而得到逐步分離。第3頁,共97頁，2024年2月25日，星期天層析法的發展過程1903年

Tswett發表了吸附色譜分離植物色素的論文，三年后他在另外兩篇論文中正式提出色譜法。1931年色譜法提出后，并未立即受到重視。經過大約20年，由于Lederer的工作，人們才重視色譜技術。1938年

Izmailov和Shraiber第一次使用薄層色譜法。1938年

Taylor和Uray用離子交換分離鋰和鉀的同位素。40年代，合成離子交換樹脂商品出現后，離子交換色譜才得到廣泛應用。1944年在美國橡樹嶺國家實驗室和衣阿華州立大學分離和鑒定了稀土元素。在1944年到50年代中，芝加哥大學和加州大學完成了超鈾元素的分離。第4頁,共97頁，2024年2月25日，星期天1941年Martin和Synge發展了分配色譜。1944年Martin等發展了紙色譜。1952年Martin和James發展了氣-液分配色譜。1956年VanDeemter等發表關于色譜效率的速率理論，并應用到氣相色譜中。1957年制作離子交換色譜氨基酸分析儀。1959年在CordonConference上提出了第一篇凝膠過濾色譜的報告。1963年Giddings的理論工作為現代液相色譜奠定了理論基礎。第5頁,共97頁，2024年2月25日，星期天60年代中期凝膠滲透色譜出現。60年代后期親和色譜出現。1969年現代液相色譜開始受到重視。有兩次諾貝爾化學獎是授予色譜學領域的研究工作：1948年瑞典科學家Tiselins由于他的關于電泳和吸附分析的研究獲獎，1952年英國的Martin和Synge因為發展了分配色譜而獲獎。第6頁,共97頁，2024年2月25日，星期天層析的原理“層析譜的本質是使一種液體均勻地滲過一個相當細碎的物質的柱體，這些物質通過某種過程有選擇地阻留了液體內的某些組分。”

——馬丁（A.J.P.Martin）（英）第7頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

層析分離法常用的層析技術有(親和層析、離子交換層析、凝膠排阻層析、凝膠電泳）特點：（1）純化倍數高（2）操作規模小，放大困難（3）

最終產品純化（4）適用于價格昂貴的產品第8頁,共97頁，2024年2月25日，星期天層析分離分類（1）按溶質分子與固定相相互作用機理吸附層析（范德華力，氫鍵，靜電力，共價力）分配層析（溶質在兩液相間分配系數不同）凝膠過濾（分子大小與形狀）實驗技術分類低壓（小于0.5Mpa)中壓(0.5-5Mpa)高壓(5-40Mpa)電泳(溶質在電場中移動）第9頁,共97頁，2024年2月25日，星期天⑴分析色譜（10mg）⑵半制備色譜(10-50mg)⑶制備色譜(0.1-1g)⑷工業生產規模色譜(>20g/d)年產10g合格的重組人粒細胞集落刺激因子（rhGcs-F），其產值高達1億元。層析分離分類（3）第10頁,共97頁，2024年2月25日，星期天層析分離分類（3）根據固定相形狀分類柱層析紙層析薄層層析根據流動相分類氣相層析液相層析超臨界流體層析按操作方式分類（展開）迎頭法（frontalanalysis)頂替法（displacementanalysis)洗脫分析（elutionanalysis)第11頁,共97頁，2024年2月25日，星期天基本概念（1）分配系數溶質在固定相與流動相濃度比值（2）解離常數有效結合位子濃度與溶質在液相的濃度乘積與溶質在固相中的濃度比值（3）分離因素某一瞬間被吸附溶質量占總量的分數

(4)

阻滯因子分配層析溶質移動速度（距離）與流動相移動速度（距離）比值

(5)

洗脫（容積）溶出體積在柱色層分離中，使溶質從柱中流出時所通過的流動相體積

(6)

分辨率兩峰之間的距離與兩峰寬的平均值之比

(7)理論塔板流動相與固定相平均濃度達傳質平衡時的一段柱高（8）溶量因子固定相中溶質總量與流動相中溶質總量之比第12頁,共97頁，2024年2月25日，星期天色層分離法基本原理第13頁,共97頁，2024年2月25日，星期天色層分離法基本原理第14頁,共97頁，2024年2月25日，星期天分子篩層析示意圖t1t0t1t2t0t0t3t1t2t0分子量：>>第15頁,共97頁，2024年2月25日，星期天分配系數在一定的溫度下，溶質在兩液相之間的平衡關系服從分配定律：

Kd=C1/C2Kd為分配系數C1，C2為兩液相中的溶質濃度。應用條件：溫度一定低濃度第16頁,共97頁，2024年2月25日，星期天解離常數和分離因數）mt-結合溶質分子的有效位子總濃度m-空余的有效結合位子濃度q-溶質在固相的濃度c-溶質在液相的濃度解離常數第17頁,共97頁，2024年2月25日，星期天圖3恒定緩沖液條件下，色層分離的拖尾現象第18頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

Rf=

阻滯因數Am—流動相的平均截面積As---固定相的平均截面積流動相的移動距離＝V/Am第19頁,共97頁，2024年2月25日，星期天洗脫容積Ve在柱色層分離中，使溶質從柱中流出時所通過的流動相的體積第20頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共97頁，2024年2月25日，星期天理論塔板fr—第r塊塔板上溶質的質量分數為：r＝nE/(E+1)時rmax＝nE/(E+1)最大濃度塔板rmax＝nE/(E+1)E=第22頁,共97頁，2024年2月25日，星期天N越大，加入的溶劑越多，展開的時間越長色帶下移高峰濃度減少、色帶擴大第23頁,共97頁，2024年2月25日，星期天層析介質要求：（1）不溶于流動相（2）化學穩定（3）機械強度（4）大的表面積（5）粒度均勻層析介質種類無機（氧化鋁，硅膠，活性碳）有機（瓊脂糖，纖維素，聚丙烯酰胺等）第24頁,共97頁，2024年2月25日，星期天常用層析介質氧化鋁：（活性氧化鋁）它是一種多孔性、高分散度固體（1）有很大的比表面積，其微孔表面具有吸附性能。（2）分子式Al2O3簡單，空間形態復雜，8種以上的形態（3）同一形態宏觀結構性質如密度、孔隙率、孔徑分布、比表面積等存在差異（4）吸附量與含水量關系很大制備：由氫氧化鋁加熱脫水得到的。吸附基團：鋁離子種類：堿性：由氫氧化鋁高溫脫水，用于堿性穩定的溶質酸性：堿性氧化鋁經鹽酸洗滌，用于在酸性穩定的溶質中性：堿性氧化鋁經水洗后活化制得應用：有機溶劑中分離天然成分第25頁,共97頁，2024年2月25日，星期天第26頁,共97頁，2024年2月25日，星期天硅膠硅膠是由多聚硅酸經分子間脫水而形成的一種多孔性物質（1）化學組成SiO2.XH20，（2）屬于無定形結構，基本結構質點為Si—O四面體，相互堆積形成硅膠的骨架。質點間的空間即為硅膠的孔隙。（3）硅膠中的水以羥基的形式和硅原子相連而覆蓋于硅膠表面。硅膠的分類（常以孔徑大小來分），(1)特細孔硅膠(0.8nm以下)。

(2)細孔硅膠（1.5—2.0nm)(3)中孔硅膠(4.0一5.0nm)(4)粗孔硅膠(10.nm以上)應用：吸附層析劑與分配層析劑優先吸附極性分子及不飽和的碳氫化合物，用于天然產物分離，可用在水溶液中或有機溶劑中第27頁,共97頁，2024年2月25日，星期天瓊脂糖由海洋生物瓊脂提取得到的主要成分

①中性不帶電②水溶性線狀多糖③高親水性，含大量羥基④能制成多孔性凝膠，分離大分子制備：

①去除帶電瓊膠成分②將溶化的瓊脂糖采用懸浮,乳化或噴珠的方法制得珠狀介質。③采用交聯劑增加介質的機械強度第28頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

瓊脂糖的基本結構單位和親水性凝膠結構a瓊脂糖結構b親水性凝膠結構第29頁,共97頁，2024年2月25日，星期天瓊脂糖（2）介質商品種類Sepharose2B,Sepharose4B,Sepharose6B。經過交聯而增加機械強度的瓊脂糖SepharoseCL-2B,SepharoseCL-4B,SepharoseCL-6B應用水溶液中分離蛋白質第30頁,共97頁，2024年2月25日，星期天葡聚糖α-1,6相連的葡萄糖聚合物，由環氧氯丙烷交聯得到珠粒性質：（1）親水性比瓊脂糖高（羥基數多）（2）化學穩定性及熱穩定性好（3）孔度與機械強度與交聯度有關（4）用于凝膠過濾分子篩應用：水溶液中分離蛋白質等第31頁,共97頁，2024年2月25日，星期天纖維素β-1,4相連的D-葡萄糖（偶而有1，6鍵合）線性天然高聚物（1）親水（2）微晶與無定型兩部分組成，缺乏孔度大孔珠狀纖維素（1）高孔度（2）高機械強度（3)親水性強應用：離子交換分離蛋白質介質第32頁,共97頁，2024年2月25日，星期天聚丙烯酰胺性質：（1）丙烯酰胺與交聯劑N,N’-甲叉雙丙烯酰胺共聚（2）烷烴骨架與酰胺側鏈（3）控制交聯劑比例可控制網格孔度（4）親水好，但不如多糖介質

(5)機械強度差應用：（1）凝膠過濾（2）電泳介質第33頁,共97頁，2024年2月25日，星期天親和層析

親和層析(AffinityChromatography)是利用生物體內存在的特異性相互作用的分子對而設計的層析方法。生物體內相互作用的分子對：(1)酶—底物或抑制劑(2)抗原—抗體(3)激素—受體(4)糖蛋白與凝集素(5)生物素—生物素結合蛋白等第34頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

基質活化方法與配基偶聯活化(activation):

基質（matrix）上的化學基團是不活潑的,無法與配基直接偶聯,通過化學反應使介質上化學基團處于活化狀態。(1)大分子配基如蛋白質等可與活化基質直接偶聯。(2)小分子配基,在基質與配基之間插入若干碳原子手臂(spacer),然后再與配基偶聯。(3)環氧氯丙烷,1,4－丁二醇縮水甘油醚本身是活化劑亦具有手臂作用。第35頁,共97頁，2024年2月25日，星期天活化方法（1）A溴化氰法溴化氰在堿性條件下與多糖上的羥基反應導入氰酯鍵或亞氨碳酸酯到基質上、進而與配基偶聯優點:（1）適用于含羥基多糖及含羥基的合成基質（2）用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶聯（3）操作步驟簡單,重現性好。（4）偶聯條件溫和,特別適用于偶聯敏感性生物大分子。缺點：（1）形成的異脲鍵易產生非特異性吸附；（2）共價鍵不穩定,配基容易脫落；（3）活化操作危險性大，反應后的殘余液需經處理再排放。

第36頁,共97頁，2024年2月25日，星期天溴化氰活化與配基偶聯化學反應式圖6第37頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

活化方法（2）B環氧氯丙烷活化

（1）所形成的共價鍵穩定,配基不易落脫（2）自動引入手臂,（3）有更小的非特異性吸附,（4）活化操作簡單易行,危險性相對較小缺點：在強堿性條件反應，不適用于堿敏感物質。第38頁,共97頁，2024年2月25日，星期天環氧氯丙烷活化反應式第39頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

環氧基的氨化及偶聯配基反應第40頁,共97頁，2024年2月25日，星期天活化方法（3）C對甲苯磺酰氯活化（1）用于活化含羥基基質、將羥基轉化為磺酰基、在配基偶聯后容易脫落、不引入電荷。（2）配基與羥基間形成穩定化學鍵。（3）活化操作需在無水丙酮環境中進行，偶聯配基根據情況、既可在有機相中進行、亦可在水相中進行。第41頁,共97頁，2024年2月25日，星期天對甲苯磺酰氯活化反應式第42頁,共97頁，2024年2月25日，星期天手臂（spacer)作用：減少親和作用空間位阻連接：通過化學反應與活化基團連接手臂化合物：乙二胺NH2-CH2-CH2-NH2已二胺NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH26-氨基已酸NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH環氧氯丙烷1、4－丁二醇縮水甘油醚第43頁,共97頁，2024年2月25日，星期天D殘余電荷的掩蔽目的：防止產生非特異性吸附原理：通過化學反應消除基團上的電荷方法：（1）自發水解（2）氨基：醋酸酐（3）羧基：水溶性碳二亞胺第44頁,共97頁，2024年2月25日，星期天手臂氨末端的掩蔽第45頁,共97頁，2024年2月25日，星期天殘留羧基掩蔽反應第46頁,共97頁，2024年2月25日，星期天E活化基團與配基密度測定方法：（1）氨基或羧基可用酸堿滴定。（2）有紫外吸收特征的、可用紫外分光法測定。（3）通過測定反應余液中配基殘留量推算（偶聯率較高的情況）（4）某些情況下需將親和膠樣品分解破壞測定第47頁,共97頁，2024年2月25日，星期天F親和介質吸附容量測定

方法：（1）流出曲線法：

流出液中目標蛋白濃度達到進口濃度的90%（2）

Langmiur吸附等溫線法第48頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

層析裝置與操作裝置1

普通2高級柱操作（1）裝柱：均勻，無氣泡（2）平衡（equilibrium)：緩沖液,pH,鹽濃度（3）上樣(loading)：蛋白濃度，pH,鹽濃度，緩沖液（4）洗滌(washing)：pH,鹽濃度，洗滌劑，緩沖液（5）洗脫(elution)：條件與吸附相反（6）清洗(cleaning)：弱酸，弱堿，蛋白質變性劑（尿素，鹽酸胍，硫氰酸鹽（7）再生：與平衡條件相同第49頁,共97頁，2024年2月25日，星期天柱層析分離法的有關裝置第50頁,共97頁，2024年2月25日，星期天Pharmacia?KTA層析系統

第51頁,共97頁，2024年2月25日，星期天Pharmacia?KTA層析系統

第52頁,共97頁，2024年2月25日，星期天裝置⑴泵⑵混合器⑶層析柱⑷檢測器⑸記錄儀⑹分部收集器第53頁,共97頁，2024年2月25日，星期天裝柱調糊：50%（緩沖液＋介質）一次連續加入懸膠液打開出口閥：層析劑沉降排除空氣檢查均勻度第54頁,共97頁，2024年2月25日，星期天上樣樣品處理：(1）溶解A調整濃度B鹽CpH(2)過濾：除去不溶物流速：根據樣品濃度與吸附速度而定上樣量：80%吸附容量第55頁,共97頁，2024年2月25日，星期天淋洗（去除殘留在介質中的雜質）鹽濃度pH表面活性劑（0.1-0.5%)淋洗體積：根據流出液雜蛋白濃度而定防止產物丟失又要除去雜質第56頁,共97頁，2024年2月25日，星期天洗脫方法按操作方式a恒定洗脫(isocraticelution)b分步洗脫(stageelution)c梯度洗脫(gradientelution)按洗脫機理專一性洗脫（specificelution）非專一性洗脫（nonspecificelution）添加劑：乙二醇,NaCNS、脲素、鹽酸胍洗脫體積：5倍床體積第57頁,共97頁，2024年2月25日，星期天恒定洗脫第58頁,共97頁，2024年2月25日，星期天分步洗脫第59頁,共97頁，2024年2月25日，星期天(c)梯度洗脫第60頁,共97頁，2024年2月25日，星期天清洗與再生弱酸：HAC堿：氨水促溶劑：1-3MKCNS、6-8M尿素、

6M鹽酸胍極性溶劑：20%乙醇表面活性劑：吐溫-80緩沖液平衡第61頁,共97頁，2024年2月25日，星期天思考題1理解概念：解離常數，分離因素，阻滯因子，理論塔板高度，洗脫體積，分辨率。2不同的層析分類方法各有何意義？3常用的層析介質有哪些？各適用于何種狀況下的分離？4親和層析的機理是什么？5配基偶聯后殘留電荷對分離有何影響？如何消除？6小分子配基為何需插入手臂？7層析柱洗脫方式有幾種？各適用于何種情況？第62頁,共97頁，2024年2月25日，星期天

第8章

色層分離法

（第二講）

第63頁,共97頁，2024年2月25日，星期天柱層析分離法的有關裝置第64頁,共97頁，2024年2月25日，星期天裝置⑴泵⑵混合器⑶層析柱⑷檢測器⑸記錄儀⑹分部收集器第65頁,共97頁，2024年2月25日，星期天裝柱調糊：50%（緩沖液＋介質）一次連續加入懸膠液打開出口閥：層析劑沉降排除空氣檢查均勻度第66頁,共97頁，2024年2月25日，星期天上樣樣品處理：(1）溶解A調整濃度B鹽CpH(2)過濾：除去不溶物流速：根據樣品濃度與吸附速度而定上樣量：80%吸附容量第67頁,共97頁，2024年2月25日，星期天淋洗（去除殘留在介質中的雜質）鹽濃度pH表面活性劑（0.1-0.5%)淋洗體積：根據流出液雜蛋白濃度而定防止產物丟失又要除去雜質第68頁,共97頁，2024年2月25日，星期天洗脫方法按操作方式a恒定洗脫(isocraticelution)b分步洗脫(stageelution)c梯度洗脫(gradientelution)按洗脫機理專一性洗脫（specificelution）非專一性洗脫（nonspecificelution）添加劑：乙二醇,NaCNS、脲素、鹽酸胍洗脫體積：5倍床體積第69頁,共97頁，2024年2月25日，星期天恒定洗脫第70頁,共97頁，2024年2月25日，星期天分步洗脫第71頁,共97頁，2024年2月25日，星期天(c)梯度洗脫第72頁,共97頁，2024年2月25日，星期天清洗與再生弱酸：HAC堿：氨水促溶劑：1-3MKCNS、6-8M尿素、

6M鹽酸胍極性溶劑：20%乙醇表面活性劑：吐溫-80緩沖液平衡第73頁,共97頁，2024年2月25日，星期天無機吸附劑羥基磷灰石(hydroxyapatite、Ca10(PO4)6(OH)2（1）純化蛋白質的無機介質。（2）廉價，易于大規模應用，（3）使用后易于清潔吸附機理與規律：偶極離子作用而不是離子交換作用(1)每一個正電荷區周圍都有負電荷區，反之亦然。（2）蛋白質在中性pH范圍具有最大的形成毗鄰正負離子的可能性。◆電性作用是它吸附蛋白質的重要原因第74頁,共97頁，2024年2月25日，星期天羥基磷灰石(HydroxyIapatite，簡稱HAP)是一種結晶狀無機鹽，屬六方晶系，存在于自然界中，與生物體有很好的相容性，也是目前分離各類生物分子最常用的液相色譜介質之一．在分離過程中，待分離分子以多種方式吸附于HAP晶體表面，即分子以不同的局部面向HAP晶體表面，并以不同方向排列．根據統計力學定律，在這些不同的吸附配置之間遵從Boltzmann分布，且能量最穩定狀態配置的幾率最高，酸性分子(pI＜7)主要吸附于c位點，堿性分子(pI>7)主要吸附于P位點．由于HAP晶面具有規則的立體化學結構，可以分辨被吸附分子表面上原子幾何排列的微小差別．因此，HAP在DNA、核苷酸、多肽以及多種蛋白質的分離中得到廣泛的應用第75頁,共97頁，2024年2月25日，星期天蛋白質在無機鹽表面的偶極作用第76頁,共97頁，2024年2月25日，星期天工藝條件吸附：(1)pH在6—9之間吸附最有可能發生（2）低濃度緩沖液離子（通常是磷酸鹽）（3）低鹽濃度洗脫：（1）增加緩沖液濃度（2）高鹽濃度中進行（3）鹽可以采用恒定或梯度形式應用。第77頁,共97頁，2024年2月25日，星期天紫球藻B—藻紅蛋白的分離純化

紫球藻（Porphyridiumcruentum)的藻紅蛋白粗提物經硫酸銨沉淀及透析后，分別用羥基磷灰石（HA）和SephadexG-100兩種方法柱層析，均可分離純化出B－藻紅蛋白（B－PE），純度（A545nm/A280nm)分別為4．92和3．78，兩種方法純化后的B－PE在聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳時均得到一條帶，B－PE的最大吸收峰在545nm，其室溫熒光發射峰為574．5nm。第78頁,共97頁，2024年2月25日，星期天藻紅蛋白可作為熒光探針，用于免疫熒光檢測、熒光顯微、組織化學等方面。藻膽蛋白還是理想的天然色素，可應用于食品、化妝品工業研究發現從螺旋藻中提取的藻藍蛋白具有直接調節和激活免疫反應的生理活性。第79頁,共97頁，2024年2月25日，星期天吸附：1mmol／L,PH6.8磷酸緩沖液預平衡(1.8cm×4cm)層析柱上樣量:2mL洗脫：磷酸鹽緩沖液1、5、50、l00、200mmol／L，PH6.8，+0.1MOL/LNaCl溶液洗脫速度:18mL/h分步收集洗脫液(每管約4mL)紫球藻B—藻紅蛋白的分離純化

第80頁,共97頁，2024年2月25日，星期天B－藻紅蛋白的洗脫曲線第81頁,共97頁，2024年2月25日，星期天體積排阻層析

SizeExclusionChromatography凝膠滲透層析

GelPermeationChromatography凝膠排阻層析

GelExclusionChromatography凝膠過濾

GelFiltration分子篩層析

GelChromatography22.9凝膠層析法第82頁,共97頁，2024年2月25日，星期天凝膠層析的用途

應用對象——主要是大分子物料，特別是蛋白質混合物。主要優點——相對成本低、操作簡便，具有相對較大規模操作的能力。其它用途——脫鹽，生物大分子按分子大小分級分離以及分子量測定等。第83頁,共97頁，2024年2月25日，星期天特性參數

排阻極限(exclusionlimit)分級范圍(Fractionationrange)吸水量（waterregains）凝膠粒徑(凝膠顆粒大小)床體積（bedvolume）空隙體積（voidvolume）第84頁,共97頁，2024年2月25日，星期天排阻極限不能進入到凝膠網絡內部的最小分子的相對分子量，稱為排阻極限。這時的洗脫體積就等于孔隙體積V0。譬如SephadaxG50的排阻極限是30kD。第85頁,共97頁，2024年2月25日，星期天分級范圍能為凝膠阻滯、并且相互之間可以得到分離的溶質的相對分子量范圍。譬如：SephadaxG50的分級范圍為1.5kD－30kD。第