第3講基因工程

-----自主梳理?再夯基礎/-------------

網緇蠲遺《I

操作對象:③

蛋

基

白

因

發展質

工

工

程

程

④.

1.（2022?江蘇高考仿真模擬調研）科研工作者在鹽堿地中找到了一種生長良

好且耐鹽堿的植物（以下簡稱植物a）。研究人員發現，植物a的液泡膜上特有一

種Na+/IC逆向轉運蛋白，這種蛋白是植物a耐鹽堿的原因，并在植物a中找到

控制該蛋白合成的Na+/K+逆向轉運蛋白基因（7hN"X2基因）。該基因就是研究人

員要找的耐鹽堿的目的基因。研究人員進一步獲得了如下圖所示的物質結構。擬

利用這些材料，用基因工程技術培育轉基因棉花。

BaniWI3AIBamH1

「目的基因’『

EcoRIEcoRI

含有目的基因的DNA片段

啟動子EcoRi

Sau3AI

復制

終止子

原點

抗生素抗性基因

農桿菌Ti質粒結構示意圖

注：Sau3AI、EcoRI、BamHI為三種限制酶，Sail3AI、BamHI切割形

成的黏性末端相同。

用基因工程技術培育轉基因棉花的操作程序包括四個步驟：

(1)目的基因的獲取：將植物a不同基因的DNA片段導入受體菌的群體中

儲存，再根據目的基因的特定序列從受體菌中提取該基因，這種獲取目的基因的

方法稱

為O

(2)構建基因表達載體：計劃用EcoRI分別切割上圖中DNA片段和上圖所

示質粒，以構建基因表達載體。

①構建表達載體除限制酶外還需要的工具酶是;

②本方案的缺陷是：可能導致以及目的基因與質粒

的反向連接。

③為避免上述缺陷，最佳方案是用切割上圖的DNA片段,

用切割上圖質粒。

(3)將導入受體細胞。成功導入受體細胞后，還需要利用

技術才能得到轉基因棉花幼苗，這一技術的原理是o

(4)目的基因的檢測與鑒定：要在個體生物學水平上檢測耐鹽新品種的培育

效果，檢測方法是。

2.(2022?南京、鹽城一模)研究發現人溶菌酶(hLZ)是天然抗生素替代品。科

學家培育出轉人溶菌酶基因山羊，以大規模生產人溶菌酶(從乳汁中提取)，過程

如下圖所示。其中編號①?⑨表示過程；質粒S中的基因Leu通過控制相關酶

的合成而影響亮氨酸的合成(亮氨酸是山羊細胞維持生命活動必不可少的一種必

需氨基酸)，基因GbP控制合成綠色熒光蛋白。四種限制酶的識別序列及切割位

點見下表。請回答下列問題。

限制酶BamHIBglUHindUlXbaI

識別序列和切割位

G1GATCCAIGATCTAIAGCTTT1CTAGA

點

BamWI

--HindWl

--Xbal

重組質粒T

質粒S

I@卵母細胞

7V

囪G/XTCCAT……GGA

-?GTA……CCTTCGA

vwv-------------------早期胚胎轉基因羊

AWWB山羊胎兒的

成纖維細胞

(1)物質A控制溶菌酶的合成包括轉錄和翻譯兩個階段，涉及的場所主要有

(2)過程①通過PCR技術擴增物質A,需要的酶是；過程②需要

的限制酶是；過程③需要的酶是限制酶和0

(3)為成功篩選出含重組質粒T的成纖維細胞，質粒S中用作標記基因的是

和o為達到篩選目的，培養基的營養成分中應不含有o

將成纖維細胞培養一段時間后觀察，篩選出_______(選填“顯示”或“不顯

示”)綠色熒光的細胞用于過程⑤。

(4)過程④常用法，過程⑨為,圖中早期胚胎的

(結構)將發育成轉基因羊。

------*增考向引領?核心突破----

核心考點1考查基因工程的基本理論

局顏瓢宿

高考對該熱點的考查形式為選擇題或非選擇題，主要命題方向：

1.結合基因工程基本概念的理解及基本操作工具的作用，考查科學思維能

力。

2.聯系轉基因技術的安全性實例，考查社會責任。

國題圖圜I

(2014?江蘇卷23)(多選)下列關于基因工程技術的敘述，錯誤的是()

A.切割質粒的限制酶均特異性地識別6個核昔酸序列

B.PCR反應中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應

C.載體質粒通常采用抗生素合成基因作為篩選標記基因

D.抗蟲基因即使成功地插入到植物細胞染色體上也未必能正常表達

筆記：___________________________________________________________

國置匾83

1.基因工程的三大操作工具

限制性內切核酸酶DNA連接酶載體

拼接DNA片段，形攜帶目的基因進入受

作用切割目的基因和載體

成重組DNA分子體細胞

能在宿主細胞內穩定

識別特定的核甘酸序

存在并大量復制；

作用列；能連接黏性末端和平

有一個至多個限制酶

特點在特定位點上切割DNA末端

切割位點；

分子

具有特殊的標記基因

2.認識PCR技術

(1)原理：體外DNA復制。

⑵需要條件：模板DNA、2種弓|物、4種脫氧核甘酸、熱穩定DNA聚合

酶(Thq酶)。

(3)過程：DNA受熱(90?95C)變性解旋為單鏈，冷卻(55?60C)后引物與

單鏈相應互補序列結合(復性)，然后在DNA聚合酶作用下延伸(70?75℃)合成

互補子鏈。

3.理解基因表達載體

啟動子:位于目的基因首端，它是RNA聚合酣識別和結合的部位，驅動轉錄出mRNA）

插入一…1目的基因位于此區間

表達載體

復制原點...終止子:位于目的基因尾端，它是使轉錄終止的一段有

可啟動“復制過程”一抗生素抗特殊結構的DNA短片段

性基因

［標記基因可作為制備篩選工程菌株選擇培養基“參照”）

1.（2022?南通四模）遞減PCR是常規PCR技術的發展，下圖表示遞減

PCR各階段溫度及時間控制。相關敘述錯誤的是（）

第1階段第2階段（10個循環）第3階段（30個循環）第4階段

96t：95t每個循環降1七；95t

0.45s\(72tX045s

4min72t:72t

\It:/1min;

/1min10min

52t/

0.45s

0.45s

,41c

保存

A.PCR反應體系中應加入Taq酶、模板DNA、dNTP、引物、緩沖液等

物質

B.第1階段的目的是使模板DNA充分解旋，減少DNA復雜結構對擴增

的影響

C.第2階段中退火溫度較高可減少引物與模板鏈的非特異性結合，為第3

階段提供更多正確的模板

D.第4階段72C下維持10min,主要目的是使子鏈與互補模板鏈結合形

成雙螺旋

2.（2022?南京師大附中開學考試）（多選）載體是基因工程中攜帶外源DNA

片段（目的基因）進入受體細胞的重要運載工具，常見的載體類型主要有基因克隆

載體和基因表達載體。下圖是利用細菌生產人胰島素的基本流程示意圖。下列相

關敘述正確的是（）

構建薊、導入小

OII

I構佳導入提取cC限制酶I細雨

體娟白■切割”丫

便一體??菌一

細菌A胰島素基因

人體染色體DNA片段

平板篩選、鑒定分析

A.重組載體A、重組載體B分別是基因克隆載體和基因表達載體

B.載體A和載體B都必須含有限制酶切割位點、復制原點和標記基因

C.必須把目的基因插入重組載體A的啟動子和終止子之間

D.培養細菌A和細菌B的培養基在營養成分和功能上沒有明顯差異

核心考點2綜合考查基因工程的操作流程及應用

高考對該熱點的考查形式為非選擇題，主要命題方向：

1.結合基因工程的操作步驟過程圖解，考查科學思維能力。

2,結合科技熱點及基因工程的應用實例，考查科學思維和探究能力。

囿國圖圖I

畫回（2021?江蘇卷?13）下圖是剔除轉基因植物中標記基因的一種策略。

下列相關敘述錯誤的是（）

無篩選標記

傳基因植株

雜交分離

A.分別帶有目的基因和標記基因的兩個質粒，都帶有TDNA序列

B.該方法建立在高轉化頻率基礎上，標記基因和目的基因需轉到不同染色

C.若要獲得剔除標記基因的植株，轉化植株必須經過有性繁殖階段遺傳重

D.獲得的無篩選標記轉基因植株發生了染色體結構變異

筆記：...........................................................

畫國（2021?江蘇卷23）某小組為研究真菌基因m的功能，構建了融合

表達蛋白M和加g標簽的質粒，請結合實驗流程回答下列問題。

SmaI

上游同源序列GGG1CCC卜'游同源序列

5,-GGATTCrAGMClAGrGGArCCCCCCCC：：GGGGAAAATTTATATTrT^AAGGTCAAT-3,

3,-CCTAAGATCin'GATCACCTAGGGGGGGGMCCCCTTTTAAATATAAAA：GTTCCAGTTA-5,

引牧四/

5,---------3’

3’---------5’經Sma1單醐切

麻刎”基因m

啟動字/ag左列

載體

混合酶處理A

5,

3’Am[f

添加同源序列的mURA3

6=0==O=j)

啟動子Sg序列URA3：酵母篩選標記基因，缺失該

基因酵母無法合成尿唯噓

Amp',大腸桿菌的篩選標記

URA3編碼氨芋背霉素抗性基因

A-m結合體

Sg序列：編碼特定氨甚酸序列

導入大腸桿菌可被特異性抗體識別

fp4>=O=^

啟動子fag序列導入酵母n表達

4=0=^培養篩選

URA3Amd融合sg標

獲得目的菌株

重組質粒A-m簽的蛋白M

(1)目的基因的擴增

①提取真菌細胞,經逆轉錄獲得cDNA,進一步獲得基因m片段。

②為了獲得融合fag標簽的蛋白M,設計引物P2時，不能包含基因加終

止密碼子的編碼序列，否則將導致o

③熱啟動PCR可提高擴增效率，方法之一是：先將除TizqDNA聚合酶(7hq

酶)以外的各成分混合后，加熱到80℃以上再混入酶，然后直接從94C開始PCR

擴增。下列敘述正確的有()

A.Taq酶最適催化溫度范圍為50-60℃

B.與常規PCR相比，熱啟動PCR可減少反應起始時引物錯配形成的產物

C.兩條子鏈的合成一定都是從5,端向3,端延伸

D.PCR產物DNA堿基序列的特異性體現了Taq酶的特異性

(2)重組質粒的構建

①將SmaI切開的載體A與添加同源序列的m混合，用特定DNA酶處理

形成黏性末端，然后降溫以促進_____________,形成A-m結合體。將A-m結

合體導入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA聚合酶及酶等，完成質粒

的環化。

②若正確構建的重組質粒A-m仍能被SmaI切開，則SmaI的酶切位點可

能在o

(3)融合蛋白的表達

①用含有尿喀咤的培養基培養URA3基因缺失型酵母，將其作為受體菌，導

入質粒A-m,然后涂布于無尿喘噬的培養基上，篩選獲得目的菌株，其機理是

②若通過抗原一抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含tag標簽，說明

后續實驗可借助tag標簽進行蛋白M的分離純化。

筆記：___________________________________________________________

H0（2020?江蘇卷?33）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的

方法，簡捷地分析出已知序列兩側的序列，具體流程如下圖所示（以EcoRi酶切

為例）。請據圖回答問題。

I酶切［EcoRl

混合的DNA片段

卡知序:列|亡知序列I卡知序:列I片段F

環狀DNA

UI擴增|物DNA聚合酶

??PCR產物

IV測序、分析|

5'.............................................................................................3'片段F的完整序列

（1）步驟I用的ECORI是一種酶，它通過識別特定的

切割特定位點。

（2）步驟n用的DNA連接酶催化相鄰核甘酸之間的3,羥基與5,磷酸間形成

;PCR循環中，升溫到95℃是為了獲得；7hq酶的

作用是催

化o

（3）若下表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物，步驟HI選用的

PCR引物必須是（從引物①②③④中選擇，填序號）。

DNA序列（虛線處省略了部分核甘酸序列）

5-AACTATGCGCTCATGA…GCAATGCGTAGCCTCT-3'

已知序列

3f-TTGATACGCGAGTACT-CGTTACGCATCGGAGA-5,

①5-AACTATGCGCTCATGA—3'

(2)5,-GCAATGCGTAGCCTCT-3,

PCR引物

@5,-AGAGGCTACGCATTGC-3,

@5,-TCATGAGCGCATAGTT-3,

（4）對PCR產物測序，經分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序

列中（虛線處省略了部分核甘酸序列），結果正確的是（）

A.5-AACTATGCG…AGCCCTT—3'

B.5-AATTCCATG…CTGAATT-3'

C.5,-GCAATGCGT-TCGGGAA-3,

D.5,-TTGATACGC-CGAGTAC-3,

筆記：...........................................................

翳圖南圖/

1.基因組文庫與部分基因文庫

基因文庫類型基因組文庫部分基因文庫（cDNA文庫）

某種生物全部DNA某種生物發育的某個時期的mRNA

!限制酣|逆轉求

構建基因

許多DNA片段cDNA

文庫的過程

）。載體連接導入|Lj我體連接導人

受體菌群體受體菌群體

2.目的基因導入受體細胞的方法

細胞種類植物細胞動物細胞微生物細胞

農桿菌轉化法、基因槍

常用方法法、顯微注射技術感受態細胞法（Ca2+處理法）

花粉管通道法

受體細胞體細胞或受精卵受精卵原核細胞

3.農桿菌轉化法的原理

植物受損傷時傷口處分泌物可吸引農桿菌f農桿菌中Ti質粒上的T-DNA

可轉移至受體細胞并整合到受體細胞染色體DNA上（若將目的基因插入到Ti質

粒的T-DNA上，則目的基因將被一起帶入）。

4.目的基因的檢測與鑒定

（2022?揚州三模）酵母細胞基因轉錄需要轉錄因子，轉錄因子包括DNA結合

功能域（DNA-BD）和轉錄激活結構域（DNA-AD）,兩結構域分開時不能激活轉錄。

如果將待測蛋白質X與DNA-BD融合，蛋白質Y與DNA-AD融合，蛋白質

X和Y有相互作用時，兩結構域能重新呈現完整轉錄因子活性，并可激活報告

基因的轉錄，過程如圖1所示。已知報告基因LacZ表達的酶可以將無色化合

物X-gal水解成藍色產物。研究人員為了驗證蛋白質X和Y是否具有相互作

用，分別構建不同的酵母表達載體（如圖2和圖3所示），其中A桃「為氨芳青

霉素（抑制細菌細胞壁的形成）抗性基因，HIS3和TRPI分別為控制組氨酸和色

氨酸合成的基因。請回答下列問題。

相標‘…"

1使用外引物赤第一次

—PCR擴增

中間產物一

I使用氟1物進行第二次

圖4巢式PCR的工作原理示意圖

（1）研究小組采用了巢式PCR技術獲取蛋白質X和Y基因的編碼區序列，

技術原理是利用兩套PCR引物進行兩輪PCR擴增（如圖4所示），首先利用第一

對引物（外引物）對目的基因所在DNA進行15?30個循環的擴增；第二輪擴增以

第一輪擴增產物為模板，利用第二對引物（內引物或巢式引物）進行15?30個循

環擴增。相比于常規PCR獲得的產物而言，巢式PCR獲得的產物特異性

（填“強”或“弱”），原因是o

（2）研究人員的主要技術路線如下表所示，請完善下表:

實驗目的方法步驟要點（部分）

巢式PCR擴增蛋白質丫編碼區序列時需在兩個

①________（填“內”“外”或“內和外”）引物的5，

獲取X和丫基因的編

端分別添加序列②___________________；為驗證目

碼區序列

的基因在PCR擴增時是否發生了基因突變，可對

PCR產物進行③____________o

用特定限制酶切割目的基因和載體并連接，連接產物

導入大腸桿菌后擴增；為確定質粒構建是否成功，需

pLexA-JL和pB42AD

要抽提兩種質粒并酶切，電泳后觀察④

載體的構建

____________________________________________________________________0

將成功構建的載體通過⑤___________法導入到營養

缺陷型酵母菌中，培養基中需添加物質有

轉化酵母細胞⑥____________（用下列字母填寫）。

a.氨茉青霉素b.色氨酸c.亮氨酸d.X-gal

e.瓊脂f.甲硫氨酸

通過觀察培養基中⑦___________來驗證蛋白質X和

實驗驗證

Y是否具有相互作用。

（3）酵母雙雜交技術在研究和鑒定蛋白質互作方面起著重要的作用。下列選

項中適合采用此技術進行研究的有。

A.在細胞體內檢測抗原和抗體能否發生相互作用

B.判斷控制某一性狀的兩對基因是否能夠獨立遺傳

C.判斷RNA聚合酶與某啟動子的結合是否具有組織特異性

D.篩選宿主細胞上能與新冠病毒S刺突蛋白特異性結合的受體

第3講基因工程

-----自主梳理?再夯基礎1Y〉-------------

【網絡構建】

①DNA連接酶②構建基因表達載體③基因

④沒有的蛋白質

【基礎自評】

1.(1)從基因文庫中獲取目的基因

(2)①DNA連接酶②目的基因和質粒的自我環化③EcoRI、I

EcoRISau3A.I

(3)目的基因植物組織培養細胞的全能性

(4)將轉基因棉花種植在鹽堿地，觀察其生長狀況

解析：(1)獲取目的基因的方法有：從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增

和人工合成法，而將植物a不同基因的DNA片段導入受體菌的群體中儲存，再

根據目的基因的特定序列從受體菌中提取該基因，這種獲取目的基因的方法稱為

從基因文庫中獲取目的基因。

(2)①構建表達載體除限制酶外還需要的工具酶是DNA連接酶，限制酶用

于切割目的基因和質粒載體，DNA連接酶用來連接目的基因和質粒載體；②用

EcoRI分別切割圖1中DNA片段和圖2所示質粒，由于只有一種黏性末端，

可能導致目的基因和質粒的自我環化以及目的基因與質粒的反向連接。③已知

Sa〃3Al、Ba〃汨I切割形成的黏性末端相同，由圖可知在目的基因兩側有

EcoRI、BamHI的識別位點，在質粒上有Sau3AI、EcoRI的識別位點，故為

避免目的基因和質粒的自我環化以及目的基因與質粒的反向連接，最佳方案是用

兩種限制酶EcoRI、BamHI切割圖1的DNA,用EcoRI、Sau3AI切割圖2

質粒。

(3)目的基因成功導入受體細胞后，要想得到轉基因棉花苗，還需要利用植

物組織培養技術，這一技術的原理是植物細胞的全能性。

(4)目的基因的檢測與鑒定有分子水平檢測和個體水平檢測，要在個體生物

學水平上檢測耐鹽新品種的培育效果，檢測方法是將轉基因棉花種植在鹽堿地，

觀察其生長狀況。

2.(1)細胞核和核糖體

(2)Taq酶BamHI、HindIIIDNA連接酶

(3)基因Leu基因GFP亮氨酸不顯示

(4)顯微注射胚胎移植內細胞團

解析：(1)溶菌酶是蛋白質，蛋白質的合成場所在核糖體，物質A是基因，

主要存在于細胞核，故物質A控制溶菌酶的合成包括轉錄和翻譯兩個階段，涉

及的場所主要有細胞核和核糖體。(2)過程①通過PCR技術擴增物質A基因，

即完成DNA體外復制，需要的酶是Taq酶（耐高溫的DNA聚合酶）。過程②是

獲取目的基因，據圖分析，B形成的黏性末端GATCC…與BamHI的識別序列

一致，黏性末端AGCTT…與“由dHI的識別序列一致，故物質B是用限制酶

BamHI、4〃dill切割的結果。過程③是將目的基因和質粒S用同種限制酶切害U，

再連接形成重組質粒，需要的酶是DNA連接酶。（3）為成功篩選出含重組質粒

T的成纖維細胞，質粒S中用作標記基因的是基因Leu和基因GFP。據第2問

的分析可知，用限制酶及》出11、4〃din切割質粒s和目的基因，形成的重組質

粒T是（Leu+XOal+B）,不含有基因GRP,無法控制合成綠色熒光蛋白，而標

記基因Leu控制合成亮氨酸，為達到篩選目的，培養基的營養成分中應不含有

亮氨酸，將成纖維細胞培養一段時間后觀察，含重組質粒T的成纖維細胞可以合

成亮氨酸而存活，只需要篩選出不顯示綠色熒光的細胞用于過程⑤即可。（4）過

程④是將目的基因導入受體細胞，動物常用顯微注射法，過程⑨為胚胎移植。圖

中早期胚胎的內細胞團是發育為胚胎本身的基礎細胞，將發育成轉基因羊。

--------^>-1考向引領?核心突破涉-----

核心考點1

【真題解讀】

ABC命題意圖：本題意在考查基因工程的基本理論，要求學生能理解所學

知識的要點，把握知識間的內在聯系。本題屬于中等難度題。

名師點睛：不同的限制酶識別的核甘酸序列的數目不同；PCR中溫度的周期

性改變是不同反應步驟需要不同的溫度，如高溫解旋，低溫復性，中溫延伸；載

體質粒通常采用抗生素抗性基因作為標記基因；外源基因導入受體細胞染色體上

后未必能正常表達。

【命題猜想】

1.D解析：PCR反應體系中應加入Taq酶（催化DNA子鏈的形成）、模板

DNA、dNTP（原料）、引物、緩沖液等物質，A正確；據圖可知，第1階段是在

96℃條件下處理4min,該階段的目的是使模板DNA在高溫下充分解旋，得到

單鏈DNA,以減少DNA復雜結構對擴增的影響，B正確；引物的堿基數量越

少，變性時破開的氫鍵越少，則退火溫度越低，但能與引物發生配對的片段就越

多，目標DNA獲得率越低，故第2階段中退火溫度較高可減少引物與模板鏈的

非特異性結合，為第3階段提供更多正確的模板,C正確；72℃下維持10min,

主要目的是使引物鏈延伸，以形成新的脫氧核甘酸鏈，D錯誤。

2.AB解析：重組載體A導入受體菌后隨著受體菌的繁殖而擴增，因此是

基因克隆載體，而重組載體B導入受體菌后，表達產生胰島素，因此是基因表達

載體，A正確；作為運載體必須要具備的條件有：含有限制酶的切割位點（便于

目的基因的插入）、復制原點（便于目的基因的擴增）及標記基因（便于篩選含有目

的基因的受體細胞）等，因此載體A和載體B都必須含有限制酶切割位點、復制

原點和標記基因，B正確；培養細菌A的目的是擴增目的基因，不需要獲得表達

產物，因此目的基因不一定要插入重組載體A的啟動子和終止子之間，C錯誤；

培養細菌A的目的是擴增目的基因，培養細菌B的目的是獲得胰島素，因此培

養兩者的培養基在營養成分和功能上有明顯差異，D錯誤。

核心考點2

【真題解讀】

畫13D命題意圖：本題以剔除轉基因植物中標記基因操作流程為載體，

考查基因工程在生產實踐中的應用，要求學生能有效提取圖中信息，并結合教材

相關知識解決相關問題。本題屬于難度較大題。

名師點睛：農桿菌中的Ti質粒上的T-DNA可轉移至受體細胞，并且整合到

受體細胞染色體的DNA上，故分別帶有目的基因和標記基因的兩個質粒，都帶

有T-DNA序列，進而成功整合到受體細胞染色體上；該方法需要利用農桿菌轉

化法，在高轉化頻率的基礎上，將目的基因和標記基因整合到染色體上，由圖可

知，標記基因和目的基因位于細胞中不同的染色體上；通過雜交分離結果可知，

經過有性繁殖階段遺傳重組后獲得了三種類型細胞，其中包括只含目的基因的、

只含標記基因的和既含目的基因又含標記基因的；獲得的無篩選標記轉基因植株

發生了基因重組。

畫國⑴①RNA②蛋白M上不含Sg標簽

③BC（2）①黏性末端堿基配對DNA連接②基因m的連接處、基因m

的內部（3）①受體菌在無尿口密咤的培養基上無法生長，導入重組質粒的受體菌

含有URA3基因可以長成菌落②融合基因表達（或融合基因正確解碼）

命題意圖：本題主要考查了基因工程的操作工具和基本步驟中的相關知識，

一方面需要學生識別圖解，另一方面需要學生對相關知識的系統理解。建議在平

時的學習中以基因工程的基本步驟為主線，注重將教材中的知識結合題中信息進

行知識遷移能力的培養。本題屬于難度大題。

名師點睛：(1)①以逆轉錄獲得cDNA的方式，要先從真菌細胞中提取基因

m轉錄出來的mRNAo

②從構建好的重組質粒上看，tag序列位于目的基因下游，若機基因的轉錄

產物mRNA上有終止密碼子，核糖體移動到終止密碼子多肽鏈就斷開，則不會

對fag序列的轉錄產物繼續進行翻譯，蛋白M上就不含fag標簽。

③從題干信息可知，“80℃以上再混入酶，然后直接從94c開始PCR擴增”，

故九應酶最適催化溫度范圍為94c左右；PCR反應的最初加熱過程中，樣品溫

度上升到70℃之前，在較低的溫度下引物可能與部分單鏈模板形成非特異性結

合，并在ZqDNA聚合酶的作用下延伸，結果會導致引物錯配形成的產物的擴

增，影響反應的特異性；熱啟動可減少引物錯配形成的產物的擴增，提高反應的

特異性；DNA分子復制具有方向性，都是從5,端向3,端延伸；距夕酶沒有特異

性，與普通的DNA聚合酶相比，7hq酶更耐高溫。

(2)①從圖上看，載體A只有一個SamI的酶切位點，故被Sami切開后，

載體由環狀變為鏈狀DNA,#SamI切開的載體A與添加同源序列的m混合,

用特定DNA酶處理形成黏性末端，然后降溫以促進載體A與添加同源序列的機

的黏性末端堿基互補配對。將A-m結合體導入大腸桿菌，利用大腸桿菌中的DNA

聚合酶及DNA連接酶等，完成質粒的環化。

②重組質粒中，載體A被I切開的位置已經與基因“7相連，原來的酶

切位點已不存在，若正確構建的重組質粒A-m仍能被I切開，則Sa/”I的

酶切位點可能在基因m的連接處或基因m內部。

⑶①篩選目的菌株的機理是：導入了質粒A-m的目的菌株由于含有URA3

基因，能在無尿噱咤的培養基上存活，而UR43基因缺失型酵母則不能存活。

②若通過抗原一抗體雜交實驗檢測到酵母蛋白中含fag標簽，位于fag標簽

上游的基因，”應該正常表達，說明融合基因表達(或融合基因正確解碼)。

回回(1)限制核甘酸序列(2)磷酸二酯鍵DNA單鏈以DNA為

模板的DNA鏈的延伸(3)②④(4)B

命題意圖：本題主要考查PCR的過程和應用，意在強化學生對PCR技術的

理解，要求學生能分析題圖提取有效信息，從引物堿基序列、延伸方向等方面進

行分析和解答，對考生的理解和分析能力提出了較高要求。本題屬于難度較大題。

名師點睛：采用PCR技術擴增DNA的過程為變性、退火、延伸、終止，

PCR技術擴增目的基因的原理：DNA雙鏈復制，引物是一小段單鏈DNA,引物

5,端的堿基可以與DNA兩條鏈的3,端的堿基進行堿基互補配對，可作為DNA復

制的起始點，子鏈的延伸方向從5'f3'。

(1)EcoRI是一種限制酶，它通過識別