關于菌種的管理和保藏菌種保藏的重要性菌種保藏是微生物檢驗工作中的一項常規技術科學保藏和管理關系到檢驗結果的正確性.第2頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

菌種的—2015版指導原則

原則：

應來自認可的國內或國外菌種保藏機構的標準菌株，或使用與標準菌株所有相關特性等效的商業派生菌株。

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使用菌種來源

菌種編號

2015版CMCC——中國醫學菌種保藏中心CMCC（F）真菌

CMCC（B）細菌

協調案ATCC美國標準菌種收藏中心

NCIMB英國食品工業與海洋菌種保藏中心

NBRC日本技術評價研究所生物資源中心CIP法國巴斯德研究所菌種保藏中心第4頁,共35頁，2024年2月25日，星期天菌種保藏的中心任務

-廣泛收集。

-選擇最適宜的保藏方法，保持菌種的生物學特性。第5頁,共35頁，2024年2月25日，星期天常用菌種的保藏

菌種保藏的原則根據微生物菌種的生理、生化特性，盡量降低微生物細胞的代謝強度，處于休眠狀態，以減低菌種的變異率。第6頁,共35頁，2024年2月25日，星期天常用菌種的保藏—2015指導原則試驗用菌株的傳代次數不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代）。采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。冷凍保藏：在低溫下保藏，一般在低于-30℃或-70℃，是有效的長期儲藏方法。凍干法保藏：是一種長期保藏菌種的方法法。冷藏：在2～8℃保藏，是短期儲藏方法。第7頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

菌種的保藏

低溫、干燥、缺氧、缺乏營養等環境條件都可以抑制微生物的代謝和生長繁殖，因此低溫、干燥和真空是菌種保藏的重要手段。

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菌種的保藏工作菌株不可代替標準菌株，標準菌株的商業衍生物僅可用作

工作菌株。

標準儲備菌株可用于制備每月或每周一次轉種的工作菌株。冷凍菌株一旦解凍轉種制備工作菌株后,不得重新冷凍或再次使用。第9頁,共35頁，2024年2月25日，星期天菌種的保藏

不同的微生物，應根據其生物特征來選擇最適宜的保藏方法：⑴

挑選特征典型的純菌菌落⑵確定保藏的合適菌體形態⑶選擇最適宜的方法保藏⑷定期檢查第10頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

菌種的保藏方法主要原理適用的微生物保藏時間特點液氮超低溫保藏法超低溫廣泛數十年復雜、需要專門設備，有效冷凍真空干燥保藏法干燥、缺氧、低溫廣泛5～10年以上復雜、需要專門設備和方法，有效干燥（沙土、牛奶）保藏法干燥、無營養產孢微生物1～10年較簡便，需制備沙土管，有效液體石蠟保藏法低溫、缺氧廣泛1年以上簡便瓊脂斜面低溫保藏法低溫4℃廣泛短時間簡便液體冷凍保藏法液體培養基低溫廣泛半年以上簡便一定比例甘油低溫、缺氧廣泛數十年以上簡便瓷珠冷凍保藏法低溫廣泛1年以上簡便第11頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

瓊脂斜面低溫保藏法菌種培養基保存溫度傳接時間金黃色葡萄球菌

營養瓊脂斜面培養基

4℃

約1個月

大腸埃希菌乙型副傷寒沙門菌枯草芽孢桿菌銅綠假單孢桿菌

室溫生孢梭菌皰肉培養基

4℃

約3個月白色念珠菌改良馬丁瓊脂斜面培養基黑曲霉第12頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

液體冷凍保藏法制備方法1%蛋白胨、甘油

,滅菌,接種、培養18-24小時.

保存條件

-80℃可保存數年.

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菌種的傳代和使用

工作菌種傳代次數不得超過5代。

1代是指將活的培養物接種到新鮮培養基中，任何亞培養的形式均被認為是轉種或傳代一次。

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基本操作技術

細菌的接種、分離和培養接種：將微生物的培養物接種到培養基上的一種操作技術。接種：斜面培養基半固體培養基液體培養基平板培養基第15頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

分離技術

將細菌分離成單個細胞，使其獨立分裂繁殖形成單個菌落的操作技術。方法

平板劃線-分段劃線、連續劃線

涂布分離法

傾注分離法等第16頁,共35頁，2024年2月25日，星期天培養

接種后的培養基，根據不同微生物生長條件的要求，培養基放在適宜微生物生長的環境中溫度、濕度、氧氣等），使其生長繁殖的過程。

需氣菌培養法:

厭氧培養法

嗜溫性微生物：15℃～45℃。嗜熱性微生物：45℃以上。嗜冷性微生物：15℃以下。第17頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

培養后微生物的生長判斷

固體培養基

有菌落生長或沿穿刺線擴散生長。

液體培養基

渾濁、菌膜、沉淀等。

第18頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

菌種的傳代和使用

凍干菌種（0代）↓增菌培養蘇醒（1代）↓增菌培養復壯（2代）→分裝冷凍保存↓斜面培養基劃線傳代（3代）→使用→分裝冷凍保存

↓

斜面培養基

劃線傳代（4代）→使用→分裝冷凍保存↓斜面培養基劃線傳代（5代）→使用→分裝冷凍保存。第19頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

斜面培養物1～3環↓適宜液體培養基5～10ml，培養18～24h取適當量，用滅菌生理鹽水稀釋后比濁（或預實驗）↓按比濁結果或預實驗將菌液稀釋到相應倍數↓平板計數(取上述稀釋液1ml加入平皿中加入

規定培養基、培養、點計菌落數↓實驗、陽性對照

平板計數也可和試驗同時進行

菌液的制備和使用第20頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

修訂前修訂后營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基；改良馬丁培養基或改良馬丁瓊脂培養基。胰酪大豆胨瓊脂或胰酪大豆胨肉湯培養基；沙氏葡萄糖瓊脂或沙氏葡萄糖肉湯培養基；馬鈴薯葡萄糖瓊脂。

菌液制備用培養基—2015修訂內容第21頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

菌株培養基培養溫度(℃)培養時間(h)枯草芽孢桿菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌胰酪大豆胨瓊脂或胰酪大豆胨肉湯。沙氏葡萄糖瓊脂或沙氏沙氏葡萄糖瓊脂或馬鈴薯葡萄糖瓊脂葡萄糖肉湯30～3520～2520～2518～242～3天5～7天，或直到獲得豐富的孢子

菌液制備用培養基—2015修訂內容第22頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

修訂前修訂后0.9％氯化鈉溶液pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

0.9%無菌氯化鈉溶液。

菌液制備用稀釋液—2015修定內容

第23頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

菌液貯存—2015修定內容

修訂前

修訂后菌液制備后若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在2-8℃，可在24小時內使用。穩定的黑曲孢子懸液可保存在2-8℃，在驗證過的貯存期內使用。第24頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

菌種的鑒定與復壯

菌種的衰退由自發突變的作用而引起某些優良特性變弱或消失的現象。控制菌種的衰退方法

-控制傳代次數降低突變幾率，采用良好的傳代保藏方法。-創造適宜的培養條件：

-用不同類型的細胞進行傳代

-采用有效的保藏方法定期檢查

第25頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

菌種的復壯采用分離純化的方法。形態特征、生理生化特征、代謝產物、血清學等一

系列試驗鑒定，證明復壯后的菌種與原種完全一致。

菌種的鑒定與復壯第26頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

微生物鑒定系統是基于不同的分析方法，其局限性與方法和數據庫的局限性有關。

微生物鑒定需通過已建立的標準微生物如模式菌株的特征(基因型和/或表型)相匹配來完成。否則將得不到鑒定的結果.

明確鑒定系統局限性和需要的鑒定水平(屬、種、型)。

菌種的鑒定第27頁,共35頁，2024年2月25日，星期天鑒定方法傳統方法增菌→分離(純菌)→確認試驗(菌落形態、革蘭染色、顯微鏡下菌體形態、生化特性及血清學檢查)。依據伯杰士細菌鑒定手冊重要的生化試驗氧化酶試驗革蘭氏陰性菌、非發酵的棒狀細菌+腸道菌-過氧化氫酶試驗葡萄球菌+鏈球菌-凝固酶試驗+

葡萄球菌可能為致病菌以上信息對大部分類型的生產環境中的微生物的調查及日常分析，已可提供足夠的信息。2015版-指導原則

菌種的鑒定第28頁,共35頁，2024年2月25日，星期天

純菌的分離

微生物的表型表型微生物鑒定通過長時間培養對微生物細胞的恢復、增殖是有限的，如有些環境中的微生物在普通微生物增殖培養基不能恢復。此外，分離出的受損的培養物可能不能完整表達其表型屬性。基因型微生物鑒定

菌種的鑒定第29頁,共35頁，2024年2月25日，星期天微生物分類中使用的表型特征分類特征培養物菌落形態學、菌落顏色、形狀、大小和產色素形態學細胞形態學、細胞大小、細胞形狀、鞭毛類型、內容

物、革蘭氏染色、芽孢和抗酸染色、孢子形成模式生理學氧氣耐受性、pH范圍、最適溫度和范圍、耐鹽性生化反應碳源的利用、碳水化合物的氧化或發酵、酶的模式抑制性膽鹽耐受性、抗生素敏感性、染料耐受性血清學凝集反應、熒光抗體化學分類脂肪酸構成、微生物毒素、全細胞組分

生態學微生物來源