天然小分子化合物誘導腫瘤細胞出泡性死亡的篩選與機制研究大多數化療藥物通過凋亡依賴的方式發揮其抗腫瘤活性。然而,除了藥物的毒副作用外,復發性腫瘤患者產生的化療藥物耐受、多藥耐藥現象普遍,嚴重制約藥物的治療效果。盡管藥物耐受的機制有很多深入細致的研究,但因其機制復雜,各種信號通路、蛋白因子交互參與,其逆轉藥物的研究一直倍受關注。研究發現,腫瘤細胞為維持自身的快速增殖,某些信號、蛋白合成與降解途徑等存在缺陷,也是耐藥的機制之一,如腫瘤細胞的凋亡機制存在異常,誘導凋亡蛋白突變、缺失等對凋亡誘導劑不敏感,產生化療耐受。因此,通過誘導腫瘤細胞以凋亡非依賴的方式死亡可能為凋亡抵抗相關的多藥耐藥惡性腫瘤的治療提供一種有效的策略和思路,相關的誘導劑研究日益增多,并證實激活非凋亡式細胞死亡或同時存在的凋亡積累可增加腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性。凋亡非依賴性細胞死亡的機制已有多種,如旁凋亡、自噬性細胞死亡、壞死性細胞凋亡、巨泡性細胞死亡等。其中旁凋亡、自噬性細胞死亡多有出泡現象伴隨,稱之為出泡性細胞死亡。旁凋亡是非凋亡性細胞死亡的形式之一,其特點為caspase非依賴并缺乏凋亡性細胞死亡的形態,細胞質內腫脹的內質網和／或線粒體產生大量空泡。雖然引起內質網和／或線粒體擴張的相關機制尚不明確,但是有研究發現蛋白質的從頭合成與內質網應激在旁凋亡過程中扮演重要角色,因為抑制蛋白的合成可以減弱空泡化現象。內質網應激還可通過引起未折疊蛋白反應(unfoldedproteinresponse,UPR)導致細胞死亡,其主要通過三條內質網傳感通路：雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內質網激酶(1proteinkinaseRNAlikeERkinase,PERK)、活化轉錄因子6(activatingtranscriptionfactor-6,ATF6)及肌醇需求酶1(inositolrequiringprotein-1,IRE1)。自噬性細胞死亡發生時,細胞胞漿產生大量游離的膜狀結構使細胞內出現“泡”狀結構,隨之形成雙層膜結構的空泡,其內部主要為“廢棄”細胞器甚至含有部分細胞漿,稱為自噬泡(Autophagosome)。就目前的研究進展,自噬泡起源尚不清楚,有人認為來自于細胞內膜性細胞器,如粗面內質網,高爾基體及其膜囊泡體等,也有人認為這些膜狀結構是重新合成的。在哺乳動物中,自噬泡的起始過程主要由Atg蛋白家族成員介導,在自噬形成過程中伴隨LC3(Microtubule-associatedprotein1lightchain3,MAP1-LC3)的參與。結果：第一部分天然化合物誘導腫瘤細胞死亡的活性篩選1.苯并喹諾里西啶類化合物誘導腫瘤細胞空泡樣死亡本論文首先利用人乳腺癌細胞(MDA-MB-231,MCF-7),人宮頸癌細胞(Hela),人慢性髓原白血病細胞(K562),人前列腺癌細胞(PC3,DU145)和人正常前列腺上皮細胞(RWPE1)為篩選模型,對35種苯并喹諾里西啶類化合物進行了活性篩選。發現苯并喹諾里西啶類化合物具有良好的抗腫瘤活性,對其中活性較高的化合物進行復篩,觀察其誘導細胞胞漿產生的空泡化現象。2.雙聯芐類衍生物協同蛋白酶體抑制劑MG132誘導腫瘤細胞空泡樣死亡前期研究發現,雙聯芐類化合物中,地錢素C(MarchantinC,MC)在體內外具有一定抗腫瘤活性,同時可以誘導腫瘤細胞旁凋亡性細胞死亡。本論文中,我們進一步將地錢素C與MG132聯用,發現在誘導腫瘤細胞胞漿空泡和死亡方面二者具有協同作用。第二部分化合物22b誘導腫瘤細胞旁凋亡的機制研究前期對新型苯并喹諾里西啶類衍生物的抗腫瘤活性篩選結果表明,此類生物堿作為抗腫瘤化合物,具有同時誘導腫瘤細胞凋亡和旁凋亡兩種死亡途徑的特征,對于化療抵抗的抗腫瘤治療有一定優勢,存在巨大的研究潛力,從中選出化合物22b為代表化合物,前列腺癌(Prostatecancer,PCa)細胞為模型進行凋亡非依賴性死亡的機制研究。1.化合物22b引起腫瘤細胞周期阻滯、凋亡和空泡化現象我們利用流式細胞技術分析了化合物22b對PCa的細胞周期及凋亡的影響,結果顯示,化合物22b可將細胞阻滯于G0/G1期,同時引起濃度依賴的一定程度的細胞凋亡。但是泛硫胱胺酸蛋白酶抑制劑(Z-VAD-fmk)未能完全逆轉化合物22b引起的胞漿內空泡和細胞死亡,所以空泡的形成在caspase依賴細胞死亡中扮演重要角色。2.化合物22b介導的旁凋亡依賴于內質網應激和蛋白合成(1)化合物22b誘導細胞內質網應激：westernblotting結果顯示,化合物22b可使內質網應激標志性蛋白GRP78的表達以時間依賴的方式上調,PERK與XBP1通路在早期被激活,表明化合物22b確實在早期可誘導由蛋白合成增加引起的內質網應激。CHOP在晚期被激活,啟動內質網應激產生的凋亡通路。(2)化合物22b依賴于內質網應激和蛋白合成介導旁凋亡：內質網應激的抑制劑4-PBA可以顯著逆轉化合物22b引起的空泡樣細胞死亡,此外,抑制蛋白翻譯的放線菌酮(CHX)和抑制蛋白質轉錄的放線菌素D(Act-D)同樣具有一定逆轉作用,說明內質網應激和蛋白合成在化合物22b引起的空泡樣細胞死亡中扮演重要角色。(3)蛋白酶體抑制劑與化合物22b具有協同作用：經典蛋白酶體抑制劑MG132和硼替佐米具有誘導內質網應激的作用,二者分別顯著增加化合物22b引起的細胞死亡,進一步驗證內質網應激在化合物22b誘導的細胞死亡中的具有重要作用。3.化合物22b通過LC3的非自噬作用引起細胞空泡化(1)自噬在化合物22b引起的細胞毒中的作用：我們將pH敏感的LC3雙熒光報告質粒轉入腫瘤細胞,加藥處理后發現自噬體并未與溶酶體融合,同時脂質型LC3BII曾加且聚集在空泡的邊緣,自噬底物p62積累。自噬的抑制劑3-MA和E-64d可在很少程度上逆轉空泡樣細胞死亡。(2)LC3的非自噬作用：利用RNA干擾技術降低LC3B的表達水平后可以顯著降低細胞內胞漿空泡的形成,以上結果提示我們,化合物22b誘導的胞漿內空泡與LC3BII存在時,非自噬的空泡形成作用相關。4.化合物22b的抗腫瘤活性在體內的驗證通過裸鼠荷瘤實驗發現化合物22b在體內同樣具有良好抑制腫瘤生長作用,同時相較于同等劑量的陽性藥物多西紫杉醇具有較低細胞毒性。第三部分地錢素C與MG132聯用誘導腫瘤細胞旁凋亡的機制研究1.地錢素C與蛋白酶體抑制劑的聯用效應在體內的驗證在裸鼠荷瘤實驗中,根據腫瘤體積及重量等數據顯示,地錢素C與蛋白酶體抑制劑存協同作用,且聯用組與高劑量硼替佐米組相比,具有相當的抑瘤效果,同時不產生明顯肝毒性。說明二者的聯用可為臨床用藥提出指導性意義。2.PLIN2可能參與地錢素C與MG132聯用誘導的細胞空泡化(1)根據基因差異表達譜芯片結果,我們篩選出協同上調5倍以上的差異基因,并進一步選擇PLIN2研究在地錢素C與MG132聯用誘導的細胞空泡化中的作用。(2)利用RNA干擾技術降低PLIN2基因表達后,地錢素C與MG132聯用引起的空泡被顯著消除,說明PLIN2可能與胞漿內空泡現象相關。結論：1.通過對多種天然化合物進行活性及誘導腫瘤細胞胞漿空泡現象的篩選,確定22b和地錢素C為潛力化合物,針對二者誘導的旁凋亡進行深入地機制研究。2.化合物22b可以引起腫瘤細胞周期阻滯、凋亡和空泡化現象。3.化合物22b誘導以空泡化現象為特征的旁凋亡依賴于內質網應激,蛋白合成以及LC3的非自噬作用。4.動物實驗的結果表明,地錢素C與蛋白酶體抑制劑存在協同作用,二者聯用可以增加抑瘤效果同時減少藥物的毒性。5.根據基因差異表達譜芯片結果篩選,PLIN2可能參與地錢素C與MG132聯用誘導的細胞空泡化。創新點與不足之處：1.創新點1.1首次報道以苯并喹諾里西啶類化合物為模型研究腫瘤細胞旁凋亡的機制,且通過實驗驗證,化合物22b引起的空泡化和細胞死亡依賴于內質網應激,蛋白合成以及LC3的非自噬作用。1.2首次報道地錢素C與蛋白酶體抑制劑具有協同作用,并在動物體內進行驗證；首次報道根據基因差異表達譜芯片結果篩選出的PLIN2可能參與地錢素C與MG132聯用誘導的細胞空泡化。2.不足2.1LC3在非凋亡依賴的細胞死亡中通過自噬途徑和非自噬性作用這兩方面扮演重要角色,有文獻報道ATF4在內質網應激產生后顯著上調,通過其轉錄因子的作用可對LC3的表達進行調節,但是否存在其他調控機制仍需深入研究。下一步工作將通過尋找與LC3相互結合蛋白確定其與空泡形成之間的關系。2.2前期結果表明,地錢素C可以抑制蛋白酶體