大腸桿菌感受態細胞的制備1可編輯課件PPT實驗目的

1.

熟悉感受態細胞制備原理。2.

掌握大腸桿菌感受態細胞制備的方法。2可編輯課件PPT3可編輯課件PPT實驗原理

在自然條件下,很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內，但在人工構建的質粒載體中,一般缺乏此種轉移所必需的基因，因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移。如需將質粒載體轉移進受體細菌，需誘導受體細菌產生一種短暫的感受態以攝取外源DNA。經一定的理化方法誘導后，處于適于攝取和容納外源DNA的細胞，稱為感受態細胞。4可編輯課件PPT目前，制備感受態細胞已成為基因操作的常規技術。感受態細胞:原核細胞或真核細胞。特點：細胞的通透性在制備過程中增強使其易于接受外源基因。細胞本身應為修飾、限制酶缺陷的菌株，使外源DNA分子不易被切除或破壞。5可編輯課件PPT制備感受態細胞可以使用電擊法或化學法。電擊法是利用瞬時高壓電流處理細胞懸浮液，使細胞膜發生去極化，產生微孔，懸液中的核酸就可通過微孔進入細胞。電擊轉化需要儀器幫助化學法則更加簡便，尤其適用于原核細胞感受態制備。6可編輯課件PPT大腸桿菌感受態制備：RuCl法CaCl2法

其原理是細胞在低溫，低滲CaCl2（0.1M）作用下，會發生膨脹，Ca2+使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結構，促使細胞外膜與內膜間隙中的部分核酸酶解離開來，誘導細胞成為感受態細胞。轉化時混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，通過熱刺激，液晶態細胞膜表面產生裂隙，使外源DNA進入細胞。7可編輯課件PPT操作步驟細菌接種與培養

取-70℃冰凍大腸桿菌DH5α菌種，用劃線法接種細菌于培養皿，做好標記，于37℃培養過夜。第二天，從平板上挑取單個菌落，接種至含有3mlLB培養液的試管中，37℃振蕩培養過夜。次日取菌液30μL接種至含有3mlLB培養基的試管中，37℃劇烈震蕩培養約2~3小時（200~300r/min）。8可編輯課件PPT菌體收集

當菌落600nmOD值達到0.3~0.4時，將試管取出放置冰上10~15分鐘。在無菌條件下，取1ml菌液裝入1.5ml離心管中。4℃,5000rpm離心5min。棄上清，將管倒置于干濾紙上1min，吸干殘留的培養液。9可編輯課件PPT制備感受態 (1)加200μL

冰預冷的0.1MCaCl2到離心管中，振蕩混勻，使菌體懸浮，冰浴30min。 (2)4℃,5000rpm離心5分鐘，棄上清，將管倒置于干濾紙上，吸干殘留液體。 (3)加50μL冰預冷的0.1M的CaCl2，重懸浮菌體，放至4℃保存備用，24~48小時內使用效果較好。如果暫時不用，可加入等體積的30%的甘油（甘油終濃度為15%），混勻。液氮速凍后保存于-80℃低溫冰箱中待用，可保存半年以上。10可編輯課件PPT注意事項

細胞的生長狀態和密度

最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。不要用已多次轉接，或貯存在4℃的培養菌液。應用對數期或對數生長前期的細菌，可通過測定培養液OD600控制。DH5α菌株的OD600

為0.5時，細胞密度在5×107

個/ml左右，過高或不足均會使轉化率下降。11可編輯課件PPT注意事項防止污染

整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等需要經高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，并注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則會影響轉化的效率或是