細菌內毒素光度測定法試驗講義講解董光宴1、光度測定法概述2、試劑和儀器3、標準曲線4、干擾試驗5、檢查法湛江博康海洋生物1/24/20241一、光度測定法概述1、定量法的概念2、定量法的分類3、定量法的原理1/24/202421定量法的概念光度測定法分為濁度法和顯色基質法：濁度法系利用檢測鱟試劑與內毒素反響過程中的濁度變化而測定內毒素含量的方法。根據檢測原理，可分為終點濁度法和動態濁度法。動態濁度法是檢測反響混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度所需要的反響時間，或是檢測濁度增加速度的方法。1/24/20243定量法濁度法顯色基質法動態濁度法終點濁度法2定量法分類1/24/202443定量法的原理〔1〕動力學曲線：細菌內毒素與鱟試劑反響過程中，隨著反響的進行，混合物會逐漸變混濁，內毒素濃度越高濁度變化越快，濁度變化符合反響動力學曲線。1/24/20245〔2〕細菌內毒素含量與時間的關系：細菌內毒素濃度與反響時間分別取對數后，將兩組數據用最小二乘法統計，可以得到直線：LgT=a+bLgC我們將這條直線稱為標準曲線。1/24/20246〔3〕、數學原理原理：OD=-Lg〔It/Io〕0.02=-Lg〔It/Io〕It=95%Io1/24/20247二試劑和儀器光度測定法鱟試劑〔生產單位：湛江博康海洋生物，批號：0907104，檢測限：0.015EU/ml；規格為1.25ml/支〕細菌內毒素檢查用水〔生產單位：湛江博康海洋生物，批號：0908030，規格：2ml/支〕1/24/20248細菌內毒素工作標準品〔200966，120EU/支，中國藥品生物制品檢定所提供〕氯化鉀注射液〔規格：1g/10ml批號：0911211，生產廠家：河北某制藥廠〕細菌內毒素定量檢測儀〔生產單位：天大天發科技有限，型號：BET-72〕1/24/20249三標準曲線1、制作標準曲線的條件2、標準曲線的選擇3、標準曲線的制作4、標準曲線有效的條件5、結果分析1/24/2024101制作標準曲線的條件當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能會影響檢驗結果的改變時，需進行標準曲線的可靠性試驗。用標準內毒素配成溶液，并制成至少3個濃度的稀釋液〔相鄰濃度間稀釋倍數不得大于10〕，最低濃度不得低于所用鱟試劑的標示檢測限。1/24/2024112標準曲線的選擇制做標準曲線的內毒素濃度可選擇10倍、5倍、4倍和2倍稀釋的等比系列點，也可選擇非等比系列點。一般情況下，我們不推薦10倍和2倍等比系列點，10倍等比系列點〔如10EU/ml、1EU/ml、0.1EU/ml和0.01EU/ml〕跨度大，其相關系數R和準確性都受到一定限制；1/24/2024122倍等比系列點〔如0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.06EU/ml〕跨度太小，其相關系數R和準確性都較好，但很不實用。我們推薦選用4倍等比系列點〔如2EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml〕跨度適中，其相關系數R和準確性都較好，而且非常實用。1/24/2024133標準曲線的制作3.1內毒素標準品的溶解稀釋首先將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水1ml溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制備成2EU/ml、1EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml備用。1/24/202414200EU/ml20EU/ml2.0EU/ml1.0EU/ml0.5EU/ml0.03EU/ml0.125EU/ml0.3ml0.3ml2.7ml2.7ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml0.5ml0.5ml圖示1/24/2024153.2定量法鱟試劑的溶解分裝

將復溶好的光度測定法鱟試劑分裝到14支定量分析專用試管中，每管分裝0.1ml。定量法鱟試劑定量試管每管0.1ml1/24/2024163.3加樣將內毒素參加定量分析專用試管中，每個濃度做3支平行管，剩下兩管參加BET水作為陰性對照，每管加樣量均為0.2ml。2EU/ml0.5EU/ml0.125EU/ml0.03EU/mlBET水1/24/202417注：產品名稱：有機玻璃試管架用

途：細菌內毒素檢查定量法中用于擺放小試管。特

點：有機玻璃材料可保護定量法小試管，防止定量法小試管被磨花而影響試驗結果。1/24/2024183.4檢測加樣完畢后用封口膜密封試管，將每支試管在旋渦混合器上點1-3秒，然后將試管對應插入已恒溫的定量檢測儀〔37℃〕，儀器開始自動采集數據。注：封口膜的優點規

格：4IN×35FT〔4英寸×35英尺〕特

點：進口代銷，比較適合用于定量法專用試管的封口，清洗時不留任何殘留物。1/24/2024194標準曲線有效的條件當陰性對照的反響時間大于標準曲線最低濃度的反響時間，將全部數據進行線性回歸分析。根據線性回歸分析，標準曲線的相關系數〔r〕的絕對值應該大于或等于0.980，試驗方為有效。平行管的變異系數＜10%。1/24/2024205結果分析內毒素反應時間變異系數實測內毒素0>720000>72002.07900.36%2.01182.07940.511591.01%0.50220.511400.12516200.34%0.12170.12516340.0323980.04%0.03180.032381

標準曲線：LogT，相關系數：

=-0.9999,標準曲線符合規定。1/24/202421四干擾試驗1、限值確實定2、干擾試驗濃度的計算3、檢測濃度的選擇4、干擾試驗溶液的制備5、供試品溶液的稀釋6、干擾試驗的制備方法7、干擾試驗加樣8、判斷的標準9、試驗結果分析10、結論1/24/2024221限值確實定2010版《中國藥典》二部正文1014頁【氯化鉀注射液】。L=0.12EU/mg1/24/2024232干擾試驗濃度的計算按照中國藥典2010年版提供的公式計算最大有效稀釋倍數〔注：其中標準曲線的最低點λ為0.015EU/ml〕。最大有效稀釋倍數：MVD=CL/λ=100Х0.12/0.015=800倍1/24/2024243檢測濃度的選擇樣品限值表達方式為EU/ml，直接選用其無干擾濃度并填寫相應稀釋倍數即可；樣品限值表達方式為EU/mg，無論其干擾情況如何，我們推薦以1mg/ml為初始濃度，選用其以下的無干擾濃度并填寫從1mg/ml開始的相應稀釋倍數，這樣檢測結果即為樣品每ml或mg中內毒素的量。我們將檢測結果直接與限值比較即可。1/24/2024254干擾試驗溶液的制備編號內毒素濃度被加入內毒素的溶液平行管數A無1.0mg/ml或0.5mg/ml至少2B標準曲線的中點（或附近點）的0.5EU/ml（設為λm）1.0mg/ml或0.5mg/ml至少2C2.0EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml、0.03EU/ml四個濃度檢查用水每一濃度至少2D無檢查用水至少21/24/2024265供試品溶液的稀釋

用細菌內毒素檢查用水將氯化鉀注射液稀釋到2.0mg/ml、1.0mg/ml和0.5mg/ml備用。操作過程必須嚴格遵守無菌操作規程，保證無外源物質的干擾。

1/24/20242710.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.3ml2.7ml1.0ml1.0ml0.3ml4.0ml1.0ml0.3ml100mg/ml圖示1/24/2024286干擾試驗的制備方法取氯化鉀注射液的2.0mg/ml、1.0mg/ml稀釋液分別參加四支試管中，每管加0.3ml，然后分別吸取0.3ml的內毒素標準溶液，濃度為1.0EU/ml按以下圖參加其中兩支試管中，另外吸取0.3ml的檢查用水參加其中另外兩支試管中。將這四支管混合均勻即可得到氯化鉀注射液的1.0mg/ml、0.5mg/ml稀釋液干擾試驗所需樣品溶液。1/24/202429氯化鉀注射液內毒素標準溶液1.0EU/ml0.3ml0.3ml0.3ml(2.0mg/ml)0.3ml(2.0mg/ml)0.3ml(1.0mg/ml)0.3ml(1.0mg/ml)BET水0.3ml0.3ml圖示1/24/2024307干擾試驗加樣

取分裝了0.1ml定量法鱟試劑的定量專用試管10支，每個濃度做2支平行管，氯化鉀注射液的1.0mg/ml、0.5mg/ml稀釋液干擾試驗各4支；另做2支陰性對照，每管加樣量均為0.2ml。加樣完畢后密封試管，將每支試管在旋渦混合器上點1-3秒，然后對應插入定量檢測儀，儀器開始采集數據。

1/24/2024310.1ml鱟試劑0.1ml鱟試劑0.1ml鱟試劑1mg/ml的加樣0.2ml0.2ml0.5mg/ml的加樣0.2ml陰性對照圖示1/24/2024328判斷的標準按所得線性回歸方程分別計算供試品溶液和含標準內毒素的供試品溶液的內毒素含量Ct和Cs，再按下式計算該試驗條件下的回收率〔R〕。R=(CS-Ct)/λm×100%當內毒素的回收率在50%-200%之間，那么認為在此該試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。1/24/202433圖示回收率：R=(CS-Ct)/λm×100%=×100%1/24/2024349試驗結果分析樣品氯化鉀注射液干擾試驗結果1/24/202435回收率R：以樣品濃度C=1.0mg/ml〔即稀釋倍數為1)以9、10、11和12管為例，計算該濃度下的回收率〔R〕。R=(CS-Ct)/λm×100%=〔〕/0.5×100%=90%注：如果檢測結果小于檢測限，計算回收率時以0計。 1/24/20243610結論結論：依據<中國藥典>2010版附錄“細菌內毒素檢查法〞，氯化鉀注射液細菌內毒素檢查干擾試驗1.0mg/ml和0.5mg/ml的稀釋液符合試驗要求，對鱟試驗沒有干擾。常規檢查選用其中任一濃度即可。1/24/202437五檢查法1檢測濃度的選擇如樣品有干擾作用，選擇符合干擾試驗要求的第二個濃度作為日常檢查的濃度。1/24/2024382試驗有效條件試驗必須符合以下三個條件方為有效：標準曲線要符合“可靠性試驗〞中的要求；計算出的內毒素的回收率要在50%-200%的范圍內；陰性對照的反響時間應大于標準曲線最低濃度的反響時間。1/24/202439

3結果判斷假設供試品溶液所有平行管的平均內毒素濃度乘以稀釋倍數后，小于規定的內毒素限值，判供試品符合規定。假設大于或等于規定的內毒素限值，判供試品不符合規定。1/24/202440六、光度測的特點1、定量儀器取值方法2、定量法的特點3、動態濁度法和凝膠法的比較1/24/202441濁度法取值法透光率反應時間取值法T0.95光密度反應時間取值法T0.02濁度反應時間取值法T501定量儀器取值方法1/24/2024421.1透光率反響時間取值法T0.95在鱟試驗中，細菌內毒素濃度與反響到達某一狀態的時刻有關，只要測出這一時間就可算出內毒素的實際濃度，這一過程叫反響時間取值方法。透光率反響時間取值法使用透光率描述鱟試劑的濁度變化。日本的ET-201型儀器采用該方法，即t0.95法。但該法所描述的透光率反響曲線與反響產物的量呈非線性關系。1/24/2024431.2光密度反響時間取值法T0.02光密度限值法預設一個光密度OD值，當反響曲線從開始上升到預設值時經理的時間作為反響時間，此方法的優點是時刻變化的OD值與反響產物的數量成正比，也就是吸光度變化曲線與凝膠產物的產生關系呈線性，取OD值上升0.02作為預設點，該點在反響曲線上的位置為濁度開始快速變化的時期，該取值能夠快速、穩定的獲得反響時間。1/24/2024441.3濁度反響時間取值法T50濁度-時間曲線法每一管的濁度總是從0-1，這就是所謂“歸一法〞，這種動態濁度法必須求出濁度到達0.5的時間t50，t50與拐點極為接近，用該點代替拐點。T50法很有優勢，但要