常用核酸提取技術介紹編輯ppt核酸〔nucleicacid〕是遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質根底。無論是進行核酸結構還是功能研究，首先需要對核酸進行別離和純化。核酸樣品質量將直接關系到實驗的成敗。前言編輯ppt核酸的存在形式核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細胞中都是以與蛋白質結合的狀態存在；真核生物的染色體DNA為雙鏈線性分子；原核生物的“染色體〞、質粒及真核細胞器DNA為雙鏈環狀分子；有些噬菌體DNA有時為單鏈環狀分子；病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多種多樣，有雙鏈環狀、單鏈環狀、雙鏈線狀及單鏈線狀等。編輯ppt編輯ppt利用DNA、RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面的差異提取DNA、RNA，去除其他成分。核酸提取的根本思路編輯ppt提取純化核酸總的原那么：①應保證核酸一級結構的完整性；②排除其它分子的污染。核酸提取的原那么編輯ppt核酸提取應到達的要求：①核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子的污染應降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。編輯ppt核酸提取應注意的問題：①盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。②減少化學因素對核酸的降解。③減少物理因素對核酸的降解：機械剪切力和高溫④防止核酸的生物降解。編輯ppt破碎提取純化I.材料準備II.破碎細胞或包膜－內容物釋放III.核酸別離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中編輯ppt細胞裂解方式分類：物理方式：煮沸法、玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法、勻漿法化學方式：外表活性劑〔SDS法〕、堿裂解法生物方式：酶法〔溶菌酶、蛋白酶K等〕編輯ppt濃鹽法：

有機溶劑抽提法：

密度梯度離心法：

利用RNA和DNA在鹽溶液中溶解度不同，將二者別離有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用利用不同內容物密度不同的原理別離各種內容物常見樣本提取方法總結：編輯ppt吸附材料結合法：硅質材料

陰離子交換樹脂磁珠

高鹽低pH值結合核酸，低鹽高pH值洗脫。快捷高效。低鹽高pH值結合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實驗。磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的物，從而到達別離目的。編輯ppt1、濃縮煮沸裂解法：〔以HBV為例〕50ul濃縮液+50ul血清12000rpm10min棄上清參加20-50ulDNA裂解液吹打混勻100℃10min12000rpm5min取上清加樣濃縮液主要成分：聚乙二醇〔PEG〕、NaCl裂解液主要成分：Tris-HCl、EDTA、NaCl、SDS常見核酸提取方法簡介編輯ppt聚乙二醇〔PEG〕HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH,n＞4PEG為有機聚合物，無毒，親水性強，相對分子量為6K-20K；PEG的沉淀效果主要與其本身的濃度和分子量有關，同時還受離子強度、溶液pH值和溫度等因素的影響，采用該方法可將病毒量濃縮10倍以上。編輯ppt裂解液裂解原理：Tris-HCl〔pH8.0〕提供一個緩沖環境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個高鹽環境，使DNA充分溶解，存在于液相中；SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫〔55～100℃〕條件下能裂解細胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；編輯ppt特點：操作相對簡單，本錢低，但抗干擾能力差，不利于自動化操作。編輯ppt原理：標本經裂解消化后，釋放出核酸，核酸與磁珠結合(特異性的和非特異性的)利用磁珠別離儀器將核酸提取純化，作為PCR反響的模板。磁珠其內核為氧化鐵，直徑0.5-50um不等，一般廣泛應用于DNA、RNA純化的磁珠為硅質膜磁珠。磁珠在高鹽條件下與核酸結合，而在低鹽環境下被洗脫，可用于全血、組織、細菌、病毒、植物的核酸純化。2、磁珠吸附法：〔以HBV為例〕編輯ppt第一步：細胞的裂解：破碎細胞，并向溶液中參加磁珠。第二步：結合核酸：pH較低，在高鹽環境下，硅膠磁珠帶正電荷，選擇性的與優化試劑中的核酸結合。主要步驟：編輯ppt第三步：洗滌：用洗滌液將非核酸成分沖洗別離〔為清洗干凈該步驟可以重復屢次〕。第四步：核酸的洗脫：pH升高，在低鹽環境下，核酸被洗脫下來。編輯ppt特點：特異性好，抗干擾能力強，易于實現半自動和全自動操作。編輯ppt原理：采用硅膠膜吸附核酸，而對其他生化組分如蛋白質、多糖、脂類既不相親也不吸附，因而可得到純化的核酸。3、硅膠柱吸附法：〔以腫瘤標本為例〕編輯ppt樣品化學裂解洗脫洗滌主要步驟：編輯ppt本卷須知：二甲苯有毒且對后續試驗有影響，一定要用乙醇洗干凈。乙醇揮發時間一定不要打折扣。加熱時要將樣品封好口，以免過熱時管子蓋崩開進水。編輯ppt核酸提取的質量控制DNA或RNA鏈上堿基的苯環結構在紫光區具有較強吸收，其吸收峰在260nm處。波長為260nm時，DNA或RNA的光密度OD260不僅與總含量有關，也隨構型而有差異。當DNA樣品中含有蛋白質、酚或其他小分子污染物時，會影響DNA吸光度的準確測定。一般情況下同時檢測同一樣品的OD260、OD280和OD230，計算其比值來衡量樣品的純度。

純雙鏈DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,說明有RNA污染；＜1.6，說明有蛋白質、酚等污染〕純RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0〔＜1.7時說明有蛋白質或酚污染；＞2.0時說明可能有異硫氰酸殘存〕

編輯ppt核酸樣品的保存：核酸保存的主要條件是溫度和介質溫度：4℃〔5℃〕最正確和最簡單-70℃是長期保存的良好溫度，為一次性保存-20℃保存保存介