分子遺傳檢測實驗室的規范化常見疾病及檢測項目單基因遺傳病：如Duchenne肌營養不良（DMD/BMD）（X性連鎖隱性遺傳病，DMD基因部分缺失或重復，以及非缺失型）、α和β地中海貧血（常染色體隱性遺傳病，α珠蛋白基因缺失或突變，β珠蛋白基因突變）等線粒體遺傳病：Leber遺傳性視神經病、線粒體腦肌病、藥物性耳聾、線粒體糖尿病等染色體非整倍體無創產前篩查（唐氏、13和18三體）常用的檢測方法PCR-Sanger測序多重連接探針擴增技術（MPLA）實時熒光PCRPCR-焦磷酸測序PCR-基因芯片雜交PCR-時間飛行質譜生物芯片系統新一代高通測序技術熒光原位雜交（FISH）臨床分子診斷技術發展歷程：幾個里程碑1953年:DNA雙股螺旋的發現1963年:放射免疫測定技術1972~1977年:重組DNA技術、核酸測序方法1983年:PCR測定技術1991-1993年:實時熒光PCR技術和芯片技術2003年：人類基因組計劃基本完成。后基因組的功能基因組研究，藥物基因組學2007年--

新一代高通量測序技術？分子遺傳檢測實驗室規范化的5W1H（Why、What、When、Where、Who、How）70%或90%以上信息來自實驗室個體化醫療（personalizedmedicine)精準醫療（precisionmedicine）移動醫療數字醫療Why實驗室醫學的時代？沒有精準檢測何來精準醫療？預測 診斷 監測 預后精準醫學計劃（Precision

Medicine

Initiative）新生兒測序計劃（BabySeqProject）實驗室醫學laboratory

medicinePCR-Sanger測序、PCR-電泳、PCR-雜交（膜上、芯片、乳膠顆粒等）、NIPT等均涉及基因擴增過程，屬于臨床基因擴增檢驗實驗室NIPT的優越性：對T21、T18和T13陽性預測值（PPV）從標準篩查方法的3.4%、14.0%和3.4%提高到80.9%、90.0%和50%。NortonMEetal.NEJM

2015,372(17)國內回顧1990年：PCR技術在國內開始用于臨床檢測1990年代中期：假陽性？（假陰性？）國內回顧1999年4月29-30日：《基因擴增技術臨床應用專家研討會》，針對臨床開展PCR檢驗的問題，達成8點意見：（1）PCR技術本身沒有問題，技術先進。（2）衛生部暫停臨床應用有助于規范管理，應在嚴格管理的基礎上適度開放。（3）限定臨床開展PCR檢驗項目上。（4）加強對PCR實驗室管理。（5）人員上崗培訓。（6）應有室內質控和參加部中心室間質評。（7）SFDA盡管批準試劑文號。（8）成立專家咨詢委員會。1999年8月17-24日：《第一期全國臨床基因擴增實驗室技術人員培訓班》在北京衛生部臨床檢驗中心舉辦2002年1月14日衛生部下發《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》（衛醫發[2002]10號）國內回顧《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》（衛辦醫政發〔2010〕194號）《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室工作導則》（衛辦醫政發〔2010〕194號）What（必要條件）檢驗申請單是合適的：對“Who”在“When”開出“What”申請單標本是正確的和好的：采集、運送和保存實驗室環境條件是好的：溫濕度、可能的干擾的避免（分區、灰塵、電磁、振動等）儀器設備狀態是好的：維護、定期校準試劑是好的：性能驗證、質檢實驗室人員是有能力的：外部和內部培訓，能力評估得到結果的過程是有監控的：室內質量控制和室間質量評價（或實驗室間比對）臨床醫生能正確的理解和應用檢驗結果于患者疾病的診斷和治療質量保證檢測申請單、標本采集、運送和保存（分析前）室內質控（分析中）室間質評（分析中）結果報告解釋及臨床應用（分析后）分析前檢驗申請單和標本采集、運送和保存中的關鍵點對“Who”在“When”開出“What”申請單容器：密閉的、一次性、無菌、無核酸酶及其他擴增抑制物采集方法：人（訓練有素）、防污染、處理運送保存時間和溫度：盡可能快？低溫？合格標本:容器完整、量夠、時間符合要求、外觀符合要求、處理符合要求用于NIPT的外周血cffDNA特點母體血漿中cffDNA含量占總游離DNA的大約5?10％，長約150bp，懷孕4周即能檢出，其在血液中的半衰期只有16min，出現2小時后即不能測出。cffDNA在母體循環中較穩定，可能與來源于胎盤的微粒能夠保護他們免受核酸酶降解相關。Cff

DNA隨著妊娠孕齡增加而增多，在前三個月每周增加21％，在孕中期上升速度較慢，在孕期的后八個星期又急劇上升。cffDNA在-20℃下可穩定超過4年，但血漿樣本在-20℃下長時間保存，cff

DNA每月以-

0.66GE/ml速率降解。Who:正常孕婦

(產篩高風險≥35歲？孕周<12周？雙胎？惡性腫瘤？夫婦染色體異常？…)When：>12周(-26+6周？)What:NIPT血漿樣本可在-18℃~-25℃短暫儲存1周，在-70℃以下儲存2年，反復凍融次數應不超過2次。分析中實驗室物理分區及空氣流向控制產前篩查與產前診斷（全基因組低拷貝測序技術）緩沖間測序區空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向文庫擴增與檢測區標本與文庫制備區試劑準備區標本與文庫制備區文庫擴增與檢測區測序區植入前胚胎遺傳學診斷(全基因組低拷貝測序)緩沖間測序區空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊文庫檢測區WGA制備區試劑準備區緩沖間緩沖間空氣流向空氣流向電泳區擴增一區遺傳病診斷+腫瘤診斷與治療（雜交捕獲測序技術+Sanger測序驗證）DNA打斷區緩沖間緩沖間雜交捕獲區（擴增一區）空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊文庫擴增區（擴增二區）標本與文庫制備區試劑準備區文庫檢測區測序區電泳區空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間緩沖間雜交捕獲區（擴增一區）空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊文庫擴增區（擴增二區）標本與文庫制備區試劑準備區文庫檢測區測序區電泳區空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間關于“分區”、緩沖間和生物安全柜“各區獨立注意風向因地制宜方便工作”緩沖間測序區空氣流向空氣流向空氣流向空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向文庫擴增與檢測區標本與文庫制備區試劑準備區實驗室應根據自己的檢驗項目、所采用的檢測技術平臺和工作量來決定分區的多少及各區域的空間大小。至少具體需要多少個區，同樣是“個體化”的，以“工作有序、互不干擾、防止污染、報告及時“作為基本原則。緩沖間的功能是“控制空氣的流向”。 生物安全柜可考慮“A2”。通風換氣？（>10次/小時）試劑方法的可靠性性能驗證（verification）？性能確認（validation）?LDTs？性能指標？精密度（重復性）準確性（正確度，方法學比較）可報告范圍（線性范圍）參考區間分析敏感性（測定下限）分析特異性抗干擾能力臨床特異性和臨床敏感性？“性能驗證”（“verification”）定義“verification”：broadlyas“confirmationthroughtheprovisionofobjectiveevidence,thatspecifiedrequirementshave

been

fulfilled”

.

（廣義為通過提供客觀證據證明特定的要求得到滿足）CLIAusestheterm“verification”：specificallytorelatetoconfirmationthatthelaboratoryusingatestcanreplicatethemanufacturer’sperformanceclaimswhenthetestisusedaccording

to

the

package

insert.

（CLIA性能驗證術語特指使用某特定檢測試劑或系統的實驗室按照所提供的試劑盒或檢測系統說明書使用時，能復現生產廠家所宣稱的檢測性能。）如果不按商品試劑盒說明書操作或改變商品試劑盒組份是否可以？可以但屬于實驗室自配試劑或自建方法，亦即Laboratory-developedtests,LDTs)“性能確認”（“validation”

）定義TheFDAandISObothdefinetheterm“validation”as“confirmation

byexaminationandprovisionofobjectiveevidencethattheparticularrequirementsforaspecificintendedusecanbeconsistentlyfulfilled”

.（通過檢查和提供客觀證據證明，對一特定預期用途的要求始終能得到滿足）TheFDAandISOtermsforverificationandaresimilar,withthedistinctionhavingtodowith

intended

use.（性能驗證和性能確認FDA和ISO術語相似，差異在后者的“預期用途”）“intended

use”預期用途Theterm“intendeduse”inthesedocumentsisestablishedbythe

manufacturerordevelopinglaboratoryatthetimeofassaydevelopmentandhastodowiththepurposeandpopulationforwhichthetestwasintended(e.g.,diagnosis,followingtreatment,etc.).Relevantperformancecharacteristicsarethendeterminedbasedontheintendeduseofthe

test.Somepeopleinterpret“intendeduse”asreferringtotherelevantclinicallaboratoryinwhichthetestisperformed,ratherthanthemanufacturerordevelopinglaboratory,thuscausingconfusion.TheWorldHealth

Organization(WHO)definesvalidationas“theaction(orprocess)ofprovingthataprocedure,process,systemequipmentormethodusedworksasexpectedand

achieves

the

intended

result”

.

（WHO將validation定義為，證明所使用的一個程序、過程、系統設備或方法能按預期進行工作以及取得預期結果的活動（或過程）“validation”

通俗一點的定義theterm“validation”willbeusedtorefertotheanalyticperformancecharacteristicsthatneedtobeinitiallyestablishedatthetimeofassaydevelopment.（指在測定方法研發時，最早建立的分析性能特征）結果報告的內容和格式遺傳檢測報告至少要包括的信息將報告與特定患者聯系在一起的惟一編號咨詢人員的姓名和聯系方式與檢測結果解釋有關的特異的信息和檢測性能檢驗項目及所使用的方法（包括檢測范圍及檢測局限性）標本類型標本接收日期檢測實驗室名稱，地點，包括咨詢實驗室檢驗結果根據檢測特性和其它提供給實驗室的信息對結果的解釋報告批準人的簽字實驗室聯系方式報告日期適當時，還應包括：建議的有資質的遺傳咨詢人員；對其他家庭成員的意義；進一步的檢測建議MM20-A.(vol.32.

No.15)Qualitymanagementformoleculargenetic

testing,Approved

guideline供參考的標準報告格式XXXXXX

醫院臨床分子檢測報告報告編號：*年齡：*樣本編碼：*臨床診斷：*采樣日期：*姓名：*送檢科室：*采樣時間：*性別：*送檢醫生：*樣本類型：*樣本的處理：*檢測方法：主要檢測儀器：*結果報告：編號 *檢測項目 *檢測結果 參考值/參考范圍*結果解釋（結果的總體描述及臨床意義）：*檢測方法的主要性能指標(至少含檢測范圍及檢測下限)：*檢測局限性：進一步檢測的建議：建議的咨詢人員及其聯系方式：參考文獻：其它(對其他可能對檢測結果產生影響的問題描述)：*收件日期：*檢測日期：*報告日期：*檢測者：*審核者：備注：實驗室地址：XX

市

XX

路X

號。郵編XXXXXX聯系電話：XXXXXXXX第頁，共

頁BrownsteinGA,etal.GenomeBiology

2014,15:R53TheCLARITY

BiologyBrownsteinGA,etal.GenomeBiology

2014,15:R53TheCLARITY

Biology結果解釋及與臨床溝通基本概念的重要性以染色體非整倍體無創產前檢測（NIPT）為例基本概念假陽性率：陽性預測值：假陰性率：陰性預測值：FP(假陽性）TN（真陰性）

FP（假陽性）×100%×100%TP(真陽性）TN(真陰性）TN（真陰性）

FN（假陰性）×100%TP（真陽性）

FP（假陽性）FN(假陰性）TP（真陽性）

FN（假陰性）×100%概念不清造成的誤解一般的唐氏篩查手段僅能檢出50%~95%的異常，且有5%的假陽性率[1,2]。根據2015年對15,841例婦女標準篩查方案的結果，21三體的陽性預測值僅為3.4%，即1000個篩查陽性結果中只有34個為真陽性[3]。NicolaidesKH.PrenatDiagn

2011;31:7–15.WrightD,etal.FetalDiagnTher2014;35:

118–26.3.NortonME,etal.NEnglJMed.2015

;372(17):1589-97.NIPT的假陽性NIPT的假陽性率為0.1%~0.2%CheungSW,LeungTY.NEJM

2015,372(17):1675-1676NIPT假陽性的原因染色體拷貝數變異（copy-numbervariation）[1]母體嵌合（maternal

mosaicism）[2,3]限制性胎盤嵌合（confined

placental

mosaicism）[2,4,5]雙胎消失綜合征（the

vanishing

twinsyndrome）[5]孕婦患有惡性腫瘤[6]1.SnyderMW,etal.NEnglJMed.2015Apr

23;372(17):1639-45.LauTK,etal.PrenatDiagn

2013;33:602-8.WangY,etal.ClinChem

2014;60:251-9.GratiFR,etal.GenetMed

2014;16:620-4.LauTK,etal.UltrasoundObstetGynecol

2014;43:254-64.OsborneCM,etal.PrenatDiagn

2013;33:609-11.NIPT假陰性原因胎兒游離DNA濃度（Fetalfraction）☆樣本處理：血漿和血細胞要盡快分離，需采用EDTA抗凝管進行樣本采集，最好在采集后6個小時內完成血漿分離，最長不能超過24小時。☆孕婦體重指數（maternal

body

mass

index，BMI）：體重高的孕婦，胎兒游離DNA濃度更低。☆孕周（Gestational

age）：在10-21孕周，胎兒游離DNA濃度每周約增加0.1%。21周后，每周增加約1%。☆胎兒非整倍體（fetal

aneuploidy）類型：21三體的胎兒游離DNA濃度更高，而18和13三體的濃度較低。單胎和多胎妊娠（singleton

and

multiple

gestations）：

如果雙胞胎是同種基因型，他們可與單胎同等有效地進行檢測，而且Z值與胎兒游離DNA濃度呈線性相關。但是，如果雙胞胎的非整倍體情況不一致，那么檢測就相對困難一些，因為每個胎兒游離DNA的濃度較單胎更低。有假陰性風險。嵌合體（mosaicism）：10%以下嵌合或低胎兒游離DNA濃度均會導致假陰性結果。染色體：GC含量中等的染色體使用MPS檢測結果最好，例如21和18染色體。13染色體GC含量低，因此需要校正GC偏倚，才能提高13三體檢測的敏感性。對于常見的染色體非整倍體，所有患者不管其風險狀態，均可以選擇游離DNA檢測作為一個篩查策略，但選擇該檢測的患者應該了解在所有可選擇的篩查和診斷方法中這種篩查方法的益處和局限性。ObstetGynecol.2015Jun29.

[Epubaheadof

print]美國婦產科醫師學會（ACOG）和美國母胎醫學會（SMGM）2015年聯合發布專家共識ObstetGynecol.2015Jun29.

[Epubaheadof

print]ObstetGynecol.2015Jun29.[Epubaheadof

print]NIPT結果應如何報告？結果報告有些實驗室用“陽性”或“陰性”，而有些則報告非整倍體的機會，最常用“>99%”表示高風險，“<1/10,000”表示低風險，這些報告方法對于產科醫生和患者不如陽性預測值或殘留風險那么有用。鑒于這些數據在為患者關于其篩查檢測結果提供準確的和可理解的信息中的重要性，美國婦產科醫師協會（ACOG）和美國母胎醫學會（SMFM）建議所有實驗室對每個染色體非整倍體檢測結果報告以“陽性預測值”和“殘留風險值”來表示ObstetGynecol.2015Jun29.

[Epubaheadof

print]When時時刻刻沒有最好只有更好！Where?Who高素質的人是最重要的高素質：專業知識技能“強”的職業意識和進取精神“認真”How硬件：實驗室（分區、環境條件等）、儀器設備及試劑、人員（持證上崗）軟件：質量保證體系（包括標本采集運送和保存及質檢、儀器設備維護校準、試劑方法性能驗證或確認和批質檢、有可操作性SOP編寫、人員培訓、室內質量控制和室間質量評價、結果報告和解釋）“無基因”或“無核酸”概念的重要性！！！尊敬的李教授：您好！來信請教一個問題，具體情況是這樣的：我這兒使用的PCR儀是ABI

7300，用的是達安公司的HBV-DNA試劑，去年12月中旬的一次試驗中發生了爆管事件，事件發生后，已經按照SOP規程進行了消毒處理，到現在已經有半年了，可還是不能消除污染。PCR實驗室在三樓，現在即使加樣操作放在同一幢樓房的一樓進行，其余如混勻、溫育、離心等還放在原來的實驗室，擴增也在原來的實驗室，陰性對照孔所加對照都未如標本一樣處理（因此暴露在空氣中的時間很短），可是陰性對照孔仍有擴增，大約在21個循環的時候開始，陰性對照顯示的Ct約為26左右。請問這是什么原因，怎么處理才能消除污染。盼指點！劉X20130508劉大夫：PCR實驗室一旦出現嚴重污染，消除將會比較困難，通常可采用下述方法：（1）開窗通風;（2）采用次氯酸鈉溶液擦地面及實驗臺面，甚至墻面;（3）增長紫外照射時間；（4）用75%乙醇空中噴霧，然后用于次氯酸鈉溶液擦地面及實驗臺面。上述措施每天都要進行，直至污染消除。不知你是否按上述方法進行？如沒有，你可以這樣試，并請將效果告訴我。此外，在實驗室出現嚴重污染后，如還要進行工作，則可臨時更換一個廠家試劑，應就可以。20130508李教授：您好！我是上次向您請教PCR實驗室污染如何清除的小劉，我們按照您的指點進行處理，現在實驗室污染已經完全清除，非常感謝！以后我們會更加注意操作的規范及相關知識的學習！2013.7.18尊敬的李教授：您好！您所說的措施我都實行過，只不過除通風外，其余措施僅實施過很少幾次，我將按您所說措施處理一段時間再看看。另外，再請教兩個問題：（1）上述措施要在三個區都進行嗎？（2）樓房第三層污染，在第一層操作怎么也會受到影響？謝謝您撥冗指教！劉X20130508好吃懶做原來是病毒在作怪2011年五大科學丑聞事件The

Scientist9月29日Mikovits被惠特莫爾?彼得森神經免疫疾病研究所（WhittemorePetersonInstituteforNeuro-ImmuneDisease，WPI）從研究主任的位置上開除。11月4日，WPI指控Mikovits在被開除后，非法消除實驗筆記，并且將其它有關研究工作信息保存在私人筆記本電腦、閃存盤和e-mail賬戶中。而WPI則獲得了臨時禁止命令，禁止Mikovits破壞