轉基因水稻和馬鈴薯植株表達人類細胞色素P450通過對除草劑解毒作用顯示交叉耐藥性YasunobuOhkawaandHideoOhkawa1植物生物技術系農業生物資源研究所日本筑波305-86021農學專業神戶大學日本神戶657-8501［摘要］轉基因植物可以表達不同種類的解毒酶，例如取自哺乳動物的細胞色素P450S單加氧酶，它們是通過農桿菌介導轉化而得。這類轉基因植物對外源化學物質產生一系列化學變化，包括對除草劑產生耐藥性。因為這類酶具有廣泛的底物特異性，所以盡管它們有著不同的作用機制和化學結構，轉基因植物對許多種除草劑仍然產生了交叉耐藥性。有耐藥性的植物可被用于除草劑的輪作制，以避免或者延遲雜草向對除草劑產生耐藥性進化。這種轉基因植物也有望被用于降低農藥對農田環境的影響。［關鍵詞］細胞色素P450，解毒，抗除草劑，轉基因植物，植物修復，雜草管理引言近年來，越來越多公司商業化培育種植抗除草劑轉基因作物。目前世界上培育的主要的轉基因農作物是大豆和玉米，其原理是攜帶了5-烯醇丙酮莽草酸-3磷酸(EPSP)合酶基因或者細菌膦乙酰轉移酶(PAT)基因(James2000,Ohkawaetal.1999)。盡管適當使用除草劑使得雜草的管理更加容易，但是重復的使用除草劑往往會誘導雜草對除草劑的耐藥性迅速發展(Benbrook1999)。其中一種延遲該抗性性進化的策略是交替使用除草劑，這種方法在許多年前已經被作為最有效的方法提出(Putwain1990)。細胞色素P450(或CYP)酶包含在植物的除草劑代謝機制中，P450聯合NADPH-細胞色素P450氧化還原酶(還原酶)以及某些除草劑發生脂溶性化合物催化氧化反應(圖1)。這些各種細胞色素P450在除草劑的選擇耐藥性中有著重要的作用(Werck-Reichhartetal.2000)。然而，因為在一個龐大的基因家族中鑒定各種細胞色素P450的功能很困難，比如說，擬南芥就有將近300多種P450(Ohkawaetal.1999)，所以這些P450的分子信息很有限。另一方面，哺乳動物肝臟微粒中的P450種類分子機制作為藥物代謝酶已經被研究的很深。這些P45參與氧化代謝異源物質包括除草劑，由于哺乳動物細胞色素P450中有一種顯示高效的除草劑代謝活性和廣泛的底物特異性(Ohkawaetal.1999)，我們才生產出能表達哺乳動物的細胞色素P450的馬鈴薯和水稻品種。P450NADP+P4E0ePRPFMNeP450P45OMUfiH4-0Srqotqfl=tCf&QQQOfljQftpL㈡口口P450NADP+P4E0ePRPFMNeP450P45OMUfiH4-0Srqotqfl=tCf&QQQOfljQftpL㈡口口QgiQCip口appnpaQpQQPQQQPQ/QSQgQ'P斗￡0還原酶NADFHROH+H20圖1 植物微粒體中細胞色素P450單加氧酶(Ohkawaetal1998)圖經過稍許翻譯處理轉基因馬鈴薯表達產生出人類細胞色素P450酶并使得對除草劑產生耐藥性CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1與CYP3A4這11種細胞肝臟中的細胞色素P450已經被報道，90%以上的藥物P450依賴性代謝機制中有它們的存在。我們檢測了重組酵母菌株的微粒體表達的11種P450,發現50次除草劑測試中有27次代謝反應中其主要代謝物質為CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19、CYP2D6以及CYP3A4。一種除草劑由不同種和亞種細胞色素P450代謝，而每種細胞色素P450可以對不同類別的除草劑發生代謝反應(Inuietal.2001)。根據上述結果，屬于不同種類和亞種的3種主要細胞色素P450，如CYP1A1、CYP2B6和CYP2C19被選擇并通過農桿菌介導方法導入馬鈴薯植株中(Solanumtuberosumcv.MayQueen)。插入人類CYP1A1、CYP2B6和CYP2C19cDNA的表達質粒pUHA1、pUHB6和pUHC19中，并分別導入質粒pUTR121H中。來自pBI121的質粒pIKBAC也是因為三個表達單元的插入而共表達出CYP1A1，CYP2B6和CYP2C19三種色素(圖2)。

HE1CYP1A11CYP2B6pIKEACCYP2C19LBWHE1CYP1A11CYP2B6pIKEACCYP2C19LBWpUHA1PUHB6PUHC19圖2表達出人類CYP的構建質粒的結構（Inuietal2000）經過了卡那霉素抗性選擇、PCR分析、7-乙氧基香豆-O-脫甲基法分析（CYP1A1活性的標準測定）以及免疫印記共四種聯合分析，在轉基因植物基因組中相應基因的存在以及它們的表達已經被Southern、Northern和Western免疫印記雜交分析證實。四種轉基因馬鈴薯植株S1965、S1972、S1974和T1977表達出CYP1A1和CYP2B6，CYP2C19，并且這三種細胞色素最終被分別篩選出來。噴灑除草劑到種植轉基因植物的花盆里后的8到15天，對除草劑有耐藥性的轉基因土豆被做出檢測。T1977植物對光合作用抑制除草劑如阿特拉津除草劑（AT）、綠麥隆除草劑（CT）和甲基苯噻隆除草劑（MT）顯示耐藥性。比較來說，沒有轉基因的馬鈴薯植株，如“MayQueen—五月皇后”植株就很容易被除草劑殺死（圖3）。盡管T1965號植株也對綠麥隆除草劑（CT）和甲基苯噻隆除草劑（MT）產生耐藥性，S1974植株對阿特拉津除草劑（AT）有輕微的耐藥性，S1972植株很容易受到這些除草劑的影響。但是轉基因植株T1977、S1972、S1974對蛋白質合成抑制除草劑如乙酰氯除草劑（AC）、異丙甲草胺殺蟲劑（MC）都產生耐藥性。然而，“MayQueen”植株以及S1965植株容易受到除草劑的影響引起頂芽枯萎或者是根本就不發芽。此外，T1977和S1965對抑制類胡蘿卜素的生物合成除草劑如噠草伏除草劑（NR）有高度耐藥性，但是“MayQueen”植株以及其他的轉基因植株的心尖部位完全變白。盡管“MayQueen”植株以及其他的轉基因植株易受到感染并且根伸長生長遲緩，但是轉基因植株T1977被脂類生物合成抑制除草劑處理如piributicarb（PC）（—種除草劑名字，未找到翻譯中文名稱）后，植株仍根伸長并正常生長。

圖3T1977植株對許多不同機制、不同結構的除草劑進行耐藥性測試依據這些結果,T1977表達了三種人類細胞色素P45O：CYP1A1和CYP2B6和CYP2C19,并高度體現了對不同反應機制和化學結構的除草劑的交叉耐藥性。S1965轉基因馬鈴薯植株僅僅只表達了一種P450細胞色素CYP1A1，這種細胞色素對1,3,5三嗪除草劑MT、苯基脲除草劑CT、噠嗪酮除草劑NR有耐藥性。S1972表達出的CYP2B6以及S1974表達出的CYP2C19也分別對乙酰氯苯胺除草劑AC和MC，AT、AC、和MC除草劑有耐藥性。在T1977中，這三種P450被認為相互聯合使得對PC除草劑產生耐藥性，如果轉基因馬鈴薯植株中僅表達出一種P450，這種PC除草劑將抑制根部的伸長和生長,S1965,S1972和S1974也一樣(Inuietal.2000)。含有人類細胞色素P450酶的轉基因馬鈴薯植株中除草劑的代謝機制取自重組酵母菌株的微粒體表達的CYP1A1代謝反應AT除草劑(Inuietal.2001),這種表達出CYP1A1的轉基因馬鈴薯對AT除草劑產生耐藥性。在CYP1A1馬鈴薯植株中的AT除草劑的代謝機制之后通過薄層色譜(TLC)分析，發現用14C標記的AT除草劑加入營養液后迅速的被帶入植株中，從植物中提取的14C的標記的代謝產物通過薄層色譜(TLC)分析后，四種代謝成分被發現，其中兩種被鑒定為DI和DIDE代謝產物。然而以前的研究發現在抗AT除草劑的小麥中的DE(Lamoureuxetal.1973)既沒有在這些轉基因植物也沒有在未轉基因植物中發現。培養8天后，無毒的DIDE在CYP1A1馬鈴薯植株中的量是未轉基因植株的五倍(表1)。薄層分析起始處顯示未知的化合物(UK2)的數量顯示在CYP1A1馬鈴薯植株中比在未轉基因植株中高。AT/代謝物代謝物產量(頃肛/植物陽天)未轉基因MayQuE相植株 CYP1A1轉基因馬鈴■薯植株AT3.0+1.32.6+0.9□1O.B+0.41.1+0.2UK10.6±0.10.S+0.2□IDE0.2±0.110+0.3UK2O.B±0.312+0.3表1轉基因馬鈴薯植株中14C標記的阿特拉津除草劑的代謝機制(Inuietal1999)UK1：未知代謝物1 UK2:未知代謝物2從這些數據中得出，轉基因馬鈴薯表達的CYP1A1被發現可以代謝AT除草劑，且代謝反應的量比在未轉基因馬鈴薯植株中更多，它主要是通過N-DI和N-DIDE產出無毒的代謝產物。在高粱中發現，抗AT除草劑的植物主要的代謝途徑是谷胱甘肽(GSH)結合(Lamoureuxetal.1973)。N-DI也曾研究發現其與谷胱甘肽結合作用比與1,3,5-三嗪對耐藥性影響強。然而，DIDE代謝物的積累，似乎對于轉基因CYP1A1馬鈴薯植株對AT除草劑產生耐藥性有著重要作用，因為它可能是通過先DI后DE途徑代謝AT除草劑產生DIDE，其DIDE產量是未轉基因植株的5倍，如圖4。因此，高耐藥性的CYP1A1馬鈴薯植株可能對CYP1A1馬鈴薯植株形成DIDE代謝物有著絕對的影響。

N小麥NHN:H.NHJC.H.HN轉基因馬鐵蓉植株匚屮曲、"NHzDI部分有垂NHCHCCH^AT-GSH【高粱N小麥NHN:H.NHJC.H.HN轉基因馬鐵蓉植株匚屮曲、"NHzDI部分有垂NHCHCCH^AT-GSH【高粱ClM/k^N阿特拉津 7DIDE無垂TransgenicpotatokNHCH^CH3I2DE部分有垂圖4在高等植物中的阿特拉津除早劑的王要代謝途徑(Inuietal1999)轉基因水稻表達產生出人類細胞色素P450酶并使得對除草劑產生耐藥性五種主要的細胞色素P450種類：CYP1A1、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C18和CYP2C19它們屬于不同的種類或者亞種并被篩選和導入水稻植株中(OryzasativaL.var.Nipponbare)。P450表達質粒的結構如圖5，這些質粒如pIES1A1、pIJ2B6、pIJ2C9、pIES2C9、pIJ2C18、pIES2C18、pIJ2C19、pIES2C19由插入人類P450cDNA的pIG121Hm構建。轉基因水稻植物是通過PEG介導轉入或者是農桿菌介導法轉入形成(Hieietal.1994)。經過潮霉素的選擇,從再生水稻植株的葉子中提取的基因組DNA，經過PCR和Southern印記雜交分析確定了P450cDNA的存在。轉基因水稻的R1種子被播撒到含有適量除草劑的土壤中，以篩選表達出P450細胞色素酶的植株。篩選出的轉基因水稻被命名為CYP1A1水稻、CYP2B6水稻等等。圖5人類CYP重組構建表達質粒結構（Hiroseetal1999）一般來說，成熟的植株比發芽的種子和幼苗更有抗除草劑能力。CYP水稻植株曾栽培在含有適當的除草劑的MS培養基中進行發芽試驗測試以檢測其除草劑耐藥性。取自于純合子的CYP2B6水稻的R2種子被播撒進含有六種除草劑的培養基中，這些除草劑已經是被來自重組酵母植株的微粒體表達的CYP2B6體外代謝過。所有的種子顯示出對蛋白質生物合成抑制除草劑如MC、AC和草不綠除草劑（AL）以及細胞分裂抑制除草劑如氟樂靈除草劑（TF）有高度的耐藥性。另一方面顯示，為轉基因的水稻既沒有在含有MC、AC或者是AL除草劑的培養基中發芽，也沒有在含有TF除草劑的培養基中發芽（圖6）。CYP2B6水稻也對蛋白質生物合成抑制除草劑如苯噻草胺除草劑（MF）和光合作用抑制除草劑如氯草敏有輕微的耐藥性。表達出CYP2C19的轉基因種子R1被播撒在含有10中除草劑的培養基中，對其中5種除草劑有耐藥性，它們分別是CT、PM、NR、MF和PC（表2）。CYP1A1水稻對光合作用抑制除草劑CT和NR、細胞分裂抑制除草劑MF以及醋酸基輔酶A碳酸酵素抑制除草劑喹禾靈（QE）都有著耐藥性。CYP2C9水稻對支鏈氨基酸生物合成抑制除草劑如氯磺隆除草劑（CS）以及唑吡嘧磺隆除草劑（IS）有耐藥性。然而，CYP2C18水稻在實驗中沒有顯示出對除草劑有明顯的耐藥性。

11CY甲氧垂草安印時乙草胺lilM氟樂靈1吐砧11CY甲氧垂草安印時乙草胺lilM氟樂靈1吐砧<￥P!hWNcvrjiijfl0J1M草不綠Z沖顯*w0口M 氯草敏300PM 苯噬草胺1.SUM圖6CYP2B6水稻對除草劑的耐藥性除草劑類別 -CyP2B6CYP2C19酵母水稻酵母水稻光合作用抑制劑ChloridazonPyridazinone19+S+dilortoluron支璉氨基酸生物合成抑制劑Phenylurea+36++Pyriminobac-meihyl類胡蘿卜素生物合成抑制劑Pyrimidinyloxybenzaic±86++Norfiu『呂工?n蛋白質生物合成抑制劑Pyridazinone++83+++AcetochlorChHoroacetoanilide42+++15NDAlachlDrChlo『oacetcanilide18+++NDMetoHachlorCliloroscetoanilide17+++43+ThenylchlorChlo『omcmtoEnilideND+++ND+PretiilachlorChlo『oacetcanilideND+++ND+Butachloir細胞分裂抑制劑ChHoroacetoanilideNDNDMefenacetOxvacet日made6+25++Trifluralin脂類生物合成抑制劑2,6-dinrtroaniliine5++NDPyributicarbThiocarbamate17++表2CYP2B6水稻和CYP2C19水稻對除草劑的耐藥性酵母一欄中的數字表示來自轉基因酵母的微粒體的代謝百分比；水稻一欄中的“+”表示對除草劑的耐藥性(Ohkawaetal.2000,Inuietal.2001)+++：生長情況與在無除草劑培養基中培養一樣++：生長情況優于對照組（非轉基因）植株+：部分生長情況優于對照植株±： 部分生長情況略微優于對照植株-： 沒有生長ND：不確定轉基因水稻植株表達的人類細胞色素P450種類對大部分的除草劑有耐藥性，相應的在酵母微粒體外代謝中表達出細胞色素P450O然而在某些情況下，如CYP2C18水稻，這種轉基因水稻植株并沒有對除草劑顯示出耐藥性，這可能是因為其體外表達出的P450酶的活性低的緣故。盡管有些例外，但是除草劑的催化實驗中，取自重組酵母菌菌株的微粒體表達的細胞色素P450酶表明在轉基因水稻植株對相應的除草劑可能有耐藥性。采用不同類別的除草劑如乙酰氯苯胺除草劑MC、AC和AL；氧乙酰胺除草劑MF；2,6-二硝基苯胺除草劑TF；氯草敏除草劑和噠嗪酮除草劑NR；硫代氨基甲酸鹽除草劑PC；2-（4-芳氧苯氧）羧酸類旋光性除草劑QE；硫酰脲除草劑IS進行測試，結果累死轉基因馬鈴薯一樣，轉基因水稻表達出的人類細胞色素P450表達出對不同種類、作用機制除草劑的耐藥性。含有人類細胞色素P450酶的轉基因水稻植株中除草劑的代謝機制采用14C標記乙基丙草胺除草劑進行TLC薄層分析法來探究CYP2B6水稻純合子R3的后代的代謝途徑。兩個14C標記的代謝物：乙基丙草胺和可能的共軛化合物在TLC薄層分析起始階段被發現。乙基丙草胺主要在培養基中而不是在植株中被發現，而共軛化合物是在植株中發現。在幾天之內，乙基丙草胺迅速被CYP2B6水稻代謝成為脫甲基形式，但是潛伏期后3天，20%以上的乙基丙草胺存在于沒有轉基因的日本晴（nipponbare）超級雜交稻中。乙基丙草胺在進一步分解之前似乎是迅速分泌到培養基中（圖7）o

起始處起始處圖7乙基丙草胺和培養基中代謝物的相對數量變化植物中剩余的乙基丙草胺以及培養基中的乙基丙草胺經過氣相色譜儀和質譜儀分析，僅僅一部分乙基丙草胺在植物中被探測到，而大部分的乙基丙草胺存在于培養基中，乙基丙草胺的攝取被認為很低。然而，CYP2B6水稻會降低本該增長的乙基丙草胺的含量，并迅速分泌代謝物，培養基中的乙基丙草胺的含量增長的很快。CYP2B6水稻植株中的乙基丙草胺的降解速度約為未轉基因日本晴(nipponbare)超級雜交稻的1.4倍。這些結果表明在體外促成的水稻CYP2B6的表達在除草劑等異型生物質的途徑對催化化學化合物有著高效的活性與潛力。結論轉基因馬鈴薯和水稻植株表達的人類細胞色素P450酶能夠降解不同作用機制和化學結構的除草劑。因為它能夠解毒的原因，轉基因植物對于許多除草劑有著交叉耐藥性。盡管大部分農作物僅對一種特殊的除草劑有耐藥性，但是有著人類細胞色素P450酶轉基因植物卻顯示著交叉耐藥性并且預計可能輪流交替對不同除草劑產生耐藥性。轉基因植物以及不同的除草劑輪流組合將可以有助于防止雜草突變產生對除草劑的耐藥性。轉基因馬鈴薯和水稻植株在培養基中先吸收除草劑，然后分解它們。有些除草劑，例如西瑪津除草劑存在于土壤中并持續一段時間的有效作用。西瑪津是一種含有阿特拉津1,3,5三嗪除草劑，并被人類CYP1A1酶降解。因此，轉基因CYP1A1馬鈴薯和水稻應該能夠從土壤中除去殘留西瑪津以促進其降解。這些轉基因植株表達的P450酶也預期可用于植物修復中發揮作用。參考文獻Benbrook,C.1999.EvidenceoftheMagnitudeandConsequencesoftheRoundupReadySoybeanYieldDragfromUniversity-BasedVarietalTrialsin1998.AgBioTechInfoNetTechnicalPaperNo.1.Ecologic.Inc.,Sandpoint,Idaho,U.S.A.().Funae,Y.,N.ObataandS.Kirigami.1998.MultiplefunctionofcytochromeP450.KanTanSui37:91.(InJapanese).Hiei,Y.,S.Ohta,T.KomariandT.Kumashiro.1994.Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.PlantJour.6:271-282.Inui,H.,Y.Ueyama,N.Shiota,Y.OhkawaandH.Ohkawa.1999.Herbicidemetabolismandcross-toleranceintransgenicpotatoplantsexpressinghumanCYP1A1.PesticideBiochemistryandPhysiology64:33-46.Inui,H.,T.Kodama,Y.OhkawaandH.Ohkawa.2000.Herbicidemetabolismandcross-toleranceintransgenicpotatoplantsco-expressinghumanCYP1A1,CYP2B6andCYP2C19.PesticideBiochemistryandPhysiology66:116-129.Inui,H.,N.Shiota,Y.Motoi,Y.Ido,T.Inoue,T.Kodama,Y.OhkawaandH.Ohkawa.2001.MetabolismofherbicidesandotherchemicalsinhumancytochromeP450speciesandintransgenicpotatoplantsco-expressinghumanCYP1A1,CYP2B6andCYP2C19.Jour.PesticideScience26:28-40.James,C.2000.GlobalStatusofCommercializedTransgenicCrops:2000.ISAAABriefsNo.21:Preview.TheInternationalServicefortheAcquisitionofAgri-biotechApplications,Ithaca,NY,U.S.A.().Lamoureux,G.L.,E.Stafford,R.H.ShimabukuroandR.G.Zaylskie.1973.Atrazineme