65.020.30B

41DB37 37/T

4204—2020水貂阿留申病診斷與凈化技術Aleutian

disease

diagnose

cleaning-up

technology

for

山東省市場監督管理局 發

布DB37/T

4204—2020 本標準按照GB/T

1.1—給出的規則起草。本標準由山東省畜牧獸醫局提出并組織實施。本標準由山東省畜牧業標準化技術委員會歸口。究所、山東省動物衛生技術中心。本標準主要起草人：王貴升、張鶴曉、馬澤芳、史秋梅、張洪學、趙國清、黃兵、徐啟杰、王蕾、李玉杰、劉長浩、徐鴻、李金波、馬慧玲、藺曉月、崔凱、陳靜、李富金、王士榮。DB37/T

4204—20201 范圍本標準規定了水貂阿留申病臨床診斷技術、病毒抗體檢測技術、熒光檢測、病獸淘汰技術、獸群飼養環境控制技術和無害化處理的技術要求。本標準適用于水貂阿留申病感染動物的篩選、感染控制與凈化。2 規范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T

6682 分析實驗室用水規格和實驗方法GB

7959 糞便無害化衛生標準GB

8978污水綜合排放標準SN/T

2847 水貂阿留申病檢疫技術規范DB37/T

2381 規模化水貂養殖場生物安全體系DB37/T

2660 規模化毛皮動物養殖場消毒技術3 臨床診斷3.1 流行病學3.1.1

90

7

個月～9

1

1

2

天～3

80

%3.1.2 傳染源主要為病貂和隱性感染貂。病毒的群間傳播主要是來自感染貂的唾液、糞便和尿，及其污染的環境、飼料、飲水和用具。經消化道、呼吸道及交配傳染，也可通過母貂胎盤直接傳遞給子代。蚊蟲叮咬、注射器針頭等傳播途徑亦應引起重視。3.1.3 有明顯的季節性，秋冬季節的發病率與病死率明顯地比其他季節高。3.1.4 本病為終生毒血癥。3.1.5 雪貂、狐貍、貉也可感染發病。3.2 臨床癥狀3.2.1 漸進性消瘦：病貂食欲時好時壞，貂體逐漸消瘦，嚴重病貂體重急劇下降。3.2.2 出血和貧血：口腔、齒齦、軟腭、硬腭和舌根有大量出血點和出血斑，內臟器官尤其是消化道出血，排出煤焦油樣糞便。貧血癥狀口腔黏膜、眼結膜和陰道黏膜及腳趾蒼白3.2.3 渴欲增強。3.2.4 如侵害神經系統，表現抽搐、痙攣、共濟失調、后軀麻痹等癥狀，2

3

天死亡。3.2.5 本病預后不良，對癥治療可緩解癥狀。常復發，最后衰竭死亡。DB37/T

4204—20203.3 病理變化3.3.1 尸體營養不良，消瘦、貧血，內臟出血。3.3.2 腎腫大

2

3

白色、圓形小點，皮質切面為乳白色小點。3.3.3 肝、脾、淋巴結腫脹，肝呈土黃色，或見有灰白色斑點、質脆；胸腺體積縮小。3.3.4 懷孕期發病可見死胎、胎兒液化、吸收或者出現木乃伊胎兒、子宮出血。3.3.5 癱瘓病例可見腦膜出血。4 抗體檢測4.1樣品的采集與保存4.1.1

離心管或者

1

mL～2

mL注射器、離心管架、剪刀或指甲剪、酒精棉、干脫脂棉、記號筆，有條件的使用采血板和毛細管。4.1.2 采血方法：將水貂保定，剪刀酒精棉消毒，中趾趾間毛細管采血或直接剪掉中趾趾尖擠出

mL～

mL

血，滴入離心管或注射器，脫脂棉壓迫止血，注明編號。4.1.3 樣品保存及運輸：2

℃～8

℃，不超過

24

h。4.2樣品處理將裝有血液的離心管靜置，待血清析出，經4

r/min離心3

～5

，取血清置于

mL離心管中。4.3 對流免疫檢測按照SN/T

2847的要求進行檢測。5 熒光

5.1 儀器設備5.1.1

熒光

檢測儀及配套反應管（板）。5.1.2

小型臺式低溫高速離心機（離心速度

13

r/min

以上）。5.1.3

混勻器。5.1.4

冰箱（2

8

℃和

℃兩種）。5.1.5

0.5

μ

L～10

μ

L；2

μ

L～20

μ

L；20

μ

L～200

μ

L；100

μ

L～1

μ

L吸頭。5.1.6

1.5

mL

離心管（無核酸酶）。5.1.7

DNA

核酸提取試劑5.2 試劑或材料5.2.1 陰性質控。5.2.2 陽性質控。5.2.3 蛋白酶

K。DB37/T

4204—20205.2.4 SDS。5.2.5 或商品化實時熒光定量

試劑盒。5.3 樣品的采集與保存5.3.1 拭子樣品有咽喉拭子樣品和肛拭子樣品：a)

3

次～5

子插入到裝有

mL

無菌離心管管中，編號備用；b)

3

5

1.0

mL

PBS

無菌管中，編號備用。5.3.2 內臟或肌肉樣品用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品

g

mL

PBS轉入無菌管中，編號備用。5.3.3血清或血漿用無菌注射器直接吸取至無菌管中，編號備用。5.3.4存放采集或處理的樣本在2

8

℃條件下保存，不超過24

h。5.4 實驗步驟5.4.1 樣本病毒核酸

普通提取方法，或者采用經驗證的病毒提取試劑盒，按照試劑盒使用說明書提取。5.4.2 擴增試劑準備5.4.2.1

VP2

168

bp

A。根據需要配制熒光

反應液或購買商品化試劑盒。5.4.2.2 熒光

反應液，在室溫下融化后，2

r/min

5

。5.4.2.3 準備

n

n（n

=樣本數

照+1

管陽性對照）。5.4.2.4 每個測試反應體系需要

μ

L

反應液和

μ

L

Taq

酶。計算好各試劑的使用量，加入一適當體積離心管中，充分混合均勻，向每個

PCR

管中各分裝

15

μ

L，轉移至樣本處理區。5.4.3 加樣在樣品處理區進行。分別向上述管中加入樣本核酸提取步驟中制備的DNA溶液10

μ

L，蓋緊管蓋，

r/min離心

sec。5.4.4 熒光

在檢測區進行。將加樣后的PCR管放入熒光檢測儀內，記錄管擺放順序。反應參數設置：第一階段，94

℃/3

min94

℃/15

sec，60

℃/60

sec共4040

℃/2

在第二階段每次循環的60

℃延伸時進行。DB37/T

4204—20205.5 結果判定5.5.1 結果分析條件的設定選定檢測通道讀取檢測結果；ABI儀器，選擇FAM作為報告熒光基團，無淬滅熒光基團。5.5.2 質控標準5.5.2.1陰性對照無

Ct/Cp

值并且無擴增曲線。5.5.2.2 陽性對照的

Ct/Cp

值應小于等于

28，并出現典型的擴增曲線。5.5.2.3 如陰性和陽性對照不滿足以上條件，此次實驗視為無效。5.5.3 結果判定陰性：無Ct/Cp值，且無特征性擴增曲線，表明樣品為陰性。陽性：Ct/Cp30.0，且出現典型的擴增曲線，表示樣品為陽性。復驗：Ct/Cp值大于30.0，且出現典型的擴增曲線的樣品建議復驗。復驗仍出現上述結果的，判為陽性，否則判為陰性。5.6 實驗室規范熒光檢測方法的實驗室規范詳見附錄B。6 病獸淘汰6.1 檢測方法的選擇：抗體檢測技術適用于群體檢測，

檢測技術適應小規模檢測和抗體陽性樣品的進一步確診。不同實驗室可以根據樣品量、樣品種類以及檢測目的選擇使用。6.2分群：定期開展檢測工作，檢測出陽性樣品后，結合臨床癥狀，初步確定陽性水貂和陰性水貂，立即分群，并對陽性貂進行隔離。6.3 一次性凈化：把檢測出的陽性水貂直接淘汰，或作為皮獸飼養，不再留作種用。6.4 逐步凈化：實行阿留申病毒陰陽性貂分場（群）飼養，逐步淘汰陽性貂。分（場）群后，應建立勿混合。7 獸群環境控制7.1 阿留申病陰性群：做好生物安全控制，日常管理遵照

DB37/T

2381

的規定執行。7.2

2660

8 無害化處理8.1 廢棄物處理對污染的飼料、墊料等廢棄物以及糞便、污水應按照GB

7959和GB

8978進行無害化處理。8.2 病死水貂處理DB37/T

4204—2020病死水貂按照農業農村部《病死及病害動物無害化處理技術規范》的規定進行無害化處理。8.3 記錄與檔案案的保存時間不得少于2DB37/T

4204—2020AA附

錄 A（資料性附錄）引物和探針F CAACCCTCCAGGTCAACTCTR CTCTTAACAGGATTCCAGCATGTP FAM-AAGCTTGCCTCTCCAAGTAAAGTAACCA-BHQ1DB37/T

4204—2020BB附

錄 B（資料性附錄）水貂阿留申病毒熒光

PCR

檢測方法的實驗室規范B.1 實驗室設置要求實驗室設置要求如下：——實驗室分為三個相對獨立的區域：樣本制備區、反應混合物配置區和檢測區；——工作區域須有明確標記，避免不同工作區域內的設備、物品混用；——每一區域須有專用的儀器設備——整個實驗過程中均須使用無

RNA

酶的一次性耗材，用到的玻璃器皿使用前須

250

℃干烤

4

h以上，以徹底去除

設備物品發生混淆；測區；——在不同的工作區域應使用不同顏色或有明顯區別標志的工作服，以便于鑒別；離開工作區時，不得將各區特定的工作服帶出；——實驗室清潔時應該樣本制備區、擴增反應混合物配置區至檢測區的順序進行；——不同的實驗區域應有其各自的清潔用具以防止交叉污染。B.2工作區域儀器設備配置B.2.1 樣本制備區樣本制備區需配置如下儀器設備：——2

℃～8

℃冰箱；——-20

℃冰箱；——高速臺式冷凍離心機（4

℃，12

000

r/min——混勻器；——微量加樣器（

μ

L～

μ

L，5

μ

L～20

μ

L，20

μ

L～

μ

L，200

μ

L～1

000

μ

L——可移動紫外燈（近工作臺面）。B.2.2 檢測區檢測區需配置如下儀器設備：——熒光

儀（配計算機）；——移動紫外燈；——打印機。B.3 各工作區域功能及注意事項DB37/T

4204—2020B.3.1 樣本制備區樣本制備區的功能及注意事項如下：——樣本的保存，核酸提取、貯存及其加入至擴增反應管在樣本制備區進行；成污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須立即蓋嚴含反應混合物的反應管；須作清潔處理并作出記錄；——對實驗臺適當的紫外照射（254

nm

波長，與工作臺面近距離）適合于滅活去污染。工作后通過移動紫外線燈管來確保實驗臺面的充分照射。B.3.