茶多酚的改性茶多酚的概述茶多酚是茶葉中一類主要的化學(xué)成分。它含量高（占總干物質(zhì)的18%?36%）,分布廣（植株各器官都有，但主要集中在嫩葉和芽），變化大（受內(nèi)外因的影響最大），對茶葉品質(zhì)的影響最顯著，是茶葉生物化學(xué)研究最廣泛，最深入的一類物質(zhì)。茶多酚一般為淡黃色至茶褐色的無定型粉末或結(jié)晶，具有澀味，略有吸潮性，其水溶液PH3-4。在pH2-7范圍內(nèi)十分穩(wěn)定，而在大于pH8以上堿性條件和光照下易氧化褐變［1］。茶葉中的多酚類物質(zhì)大多屬于縮合單寧，因其大部分溶解于水，所以稱為水溶性單寧。它是由黃烷醇類（兒茶素類），花色素類（花白素和花青素），花黃素類（黃酮及黃酮醇類），酚酸及縮酚酸類組成。除酚酸及縮酚酸類以外，其他幾種化合物由于都具有2-苯基苯并吡喃的基本結(jié)構(gòu)，所以可統(tǒng)稱為類黃酮化合物。其中兒茶素類化合物是茶多酚的主要成分，約占茶多酚含量的65%?80%左右。主要的兒茶素包括：（+）兒茶素（C）,（-）表兒茶素（EC）,（-）沒食子兒茶素（GC）,（-）表兒茶素沒食子酸酯（ECG）,（-）表沒食子兒茶素（EGC）,（-）表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）六種物質(zhì)。其結(jié)構(gòu)式可表示為⑵:0H0H0H0HH00H00H0H0H0HEGCECC0H0H0H0HH00H00H0H0H0HEGCECCQH CHECG GCGOHEGCG圖1兒茶素的幾種化合物的結(jié)構(gòu)

茶多酚的提取純化及其改性的研究兒茶素的幾種化合物極性相似,分子量區(qū)別也不大,其單一化合物的提取分離并不容易。幾種化合物在茶葉浸出物中的含量也是有差異的。在各種茶葉中EGCG的含量都是最高的，而EC都是最高的。茶多酚抗氧化機理目前的研究表明茶多酚抗氧化、清除自由基作用,主要有4個機制:茶多酚中的兒茶酚(鄰苯二酚)結(jié)構(gòu)具有很強的金屬離子螯合能力,從而降低了金屬離子對氧化反應(yīng)的催化作用;茶多酚能夠清除超氧陰離子自由基和羥自由基,從而減少對細胞DNA和其它分子的氧化損傷;抑制氧化酶,減少自由基生成;通過猝滅自由基,增強抗氧化酶活性,如增強谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、酯還原酶、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶的活性；茶多酚能與過氧自由基發(fā)生反應(yīng),從而終止脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)［3］。茶多酚的改性研究茶多酚進行改性的原因茶多酚作為一種天然抗氧化劑,具有很強的抗氧化性,對油脂的氧化抑制率達96%以上,但是茶多酚中的主要功能物質(zhì)兒茶素類脂溶性較差,直接添加到油相中會出現(xiàn)凝聚和沉淀現(xiàn)象,使得茶多酚的抗氧化性的生物利用度低［4］。雖然有些文獻中將茶多酚直接添加如油相中也能起到比其他添加劑強的抗氧化能力伍?8］，但是這始終是一個不穩(wěn)定的體系，通過加熱超聲波等方法可以暫時做到茶多酚分子的分散，可是冷卻離心長時間靜置均會出現(xiàn)分子凝聚沉淀，從而造成抗氧化能力的減弱。因此,許多研究對其進行改性,使得水溶性茶多酚改性為脂溶性茶多酚,增加其在油相中的溶解性,從而增強茶多酚的抗氧化性。茶多酚的改性方式溶劑法溶劑法添加茶多酚的原理是利用茶多酚在一些食用溶劑中溶解能力強的特點先將茶多酚溶解在溶劑中做成濃縮抗氧化劑再添加到食用油脂中。這種方法多在研究茶多酚在油脂中的抗氧化性能時使用。如劉國敏［9］在研究復(fù)合型抗氧化劑對油炸食品保鮮作用時，采用的食用酒精配成的10%的抗氧化劑溶液，結(jié)果對油炸面片起到明顯的抗氧化作用。何達崇等［10］對油梨油抗氧化研究在添加了POT-4型添加劑，比BHT和BHA抗氧化能力強。Z.Y.Chen在考察茶葉的乙醇提取物對Canolaoil抗氧化作用時［⑴，以及在對比茶多酚與迷迭香的抗氧化性能時［12］，分別將茶多酚溶解在乙醇中添加到Canolaoil液體豬油和雞油中。吳天榮［13］用了三種溶劑溶解茶多酚在菜籽油中的抗氧化效果。鄭雄敏［14］將溶解在溶劑中的茶多酚加入豆油和菜油。Hara】i5］等也是用乙醇類溶劑作為載體添加到油脂中。盡管，從研究的角度出發(fā)可以得到滿意的對比效果。但是，這種方法要想在實際的大宗食用油脂中添加，需要考慮穩(wěn)定性和油脂的煙點的問題。一般食用油脂衛(wèi)生標準中檢測煙點、水分及揮發(fā)物［16］，檢測溫度都很高。在這種條件下一般的食用溶劑都會揮發(fā)，從而導(dǎo)致兩項指標的不合格。有些研究者用45r氮氣或加熱法［17］將溶劑從菜籽油中去除。但由于溶劑的去除，造成茶多酚在油脂和溶劑相中重新分配，三相分配平衡后的結(jié)果是造成茶多酚重新析出。Todd,Jr［i8］從兒茶素的提取工藝入手，采用與水無共沸現(xiàn)象的溶劑直接萃取兒茶素避免了大量水溶性物質(zhì)同時萃出。在制備脂溶性兒茶素時，將兒茶素干粉與C8-C18的食用脂肪醇類物質(zhì)混合，可以使貨價期延長半年，并通過了200r的高溫穩(wěn)定試驗。雖然此種方法可以獲得穩(wěn)定的脂溶性產(chǎn)品，但是，單獨可添加的兒茶素量與抗氧化要求有距離。乳化法乳化法是將茶多酚制成W/0型乳劑添加在色拉醬、方便面及其湯料、肉糜、魚糜、冰淇淋及乳奶液中。如日本a將茶提取物10%配以2%檸檬酸、7%VE和30%的甘油脂肪酸酯，再加上51%的食品輔料制成的油性茶提取物，在色拉調(diào)味劑中抗氧化性能明顯。Noaykui［20］將幾種兒茶素與油溶性物質(zhì)一起在70?90°C乳化，冷卻后加入冰淇淋中作為穩(wěn)定劑和抗氧化劑。Kazuhior】21］也將茶多酚與其它增效劑一起制成W/O乳劑。Yoshi［22］制備乳劑的工藝比較復(fù)雜，10g茶多酚及10g檸檬酸加入10g水中混合后，加入LHB=3的蓖麻醇酸甘油醋30g，然后再添加VE10g和豆油30g，充分均質(zhì)得到穩(wěn)定的食用抗氧化劑。Itaru［23］將10g左右的茶提取物用15g左右的蒸餾水溶解后，與HLB=6?10的乳化劑（如甘油月桂酸酯）加熱混合后，在加入蓖麻醇酸甘油酯和經(jīng)媒介生產(chǎn)的卵磷脂，所得抗氧化劑脂溶性能極佳。在大宗油品中，使用的乳化型茶多酚抗氧化劑多為抗豬油、雞油、牛羊油等室溫凝固型動物油脂。因為在這一體系中，對油品的透明度、澄清度都無要求，只要凝固之前可以充分分散在豬油中，不引起破乳化現(xiàn)象就行。姜紹通［24］等用單甘酯、磷脂、SPan60和Tween6等乳化劑加熱至80C，攪拌加入豬油，隨后加入茶多酚水溶液均質(zhì)后得到乳化均勻分布體系。而且在試驗中發(fā)現(xiàn)，磷脂作乳化劑對豬油抗氧化性能最佳。徐向前［25］等將茶多酚粉劑溶在熱水中，攪拌加入含聚乙二醇聚醚類乳化劑的油中，制成脂溶性茶多酚，加入豬油后可明顯延長豬油氧化反應(yīng)的誘導(dǎo)期。伍秋明［26］等對比了豬油、牛羊油中添加茶多酚乳劑與化學(xué)合成抗氧化劑的區(qū)別。雖然也可見到將乳化茶多酚加入植物油中的研究報告，但是按照食用植物油的衛(wèi)生標準，添加水分后會加速植物油的酸敗，也會造成植物油的水分和可揮發(fā)物含量、透明度、粘度指標不合格。分子修飾法分子修飾法是利用生物或化學(xué)合成的方法，將茶多酚中幾種兒茶素的分子結(jié)構(gòu)的某些部位酰化或酯化，使得新構(gòu)成的分子由水溶性改性為脂溶性的方法。目前分子修飾法可以分為酶法修飾和化學(xué)修飾兩種。（1）酶法修飾此法最先是Tobiason［27］從研究兒茶素的3-0-酰化衍生物的分子軌道開始的。1994年Sakai［28］等獲得酶法合成的3-0-兒茶素系列物質(zhì)的專利，并將其應(yīng)用在油脂抗氧化劑領(lǐng)域。QHcarboxy兒茶絮OHCJK C=03—0—灘基幾叢董商化勒QHcarboxy兒茶絮OHCJK C=03—0—灘基幾叢董商化勒圖璨^Oft^bn酶法修飾兒茶素”為芳香族、甘油基、甘油醜基或1——10個碳的烷基羧基酯化酶由Streptomycesrochei或黑曲霉中獲得，反應(yīng)條件溫和。1mol的兒茶素分子加入1?10mol的酯化物，每克兒茶素需100?5000單位的酶分子，穩(wěn)定控制在20?60°C,pH4?7。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過ODS柱、聚酰胺柱多次吸附、解析，最終產(chǎn)品得率45%。產(chǎn)品添加到油脂中溶解性能良好，抗氧化誘導(dǎo)時間也比空白延長一倍。沈生榮［29］引述了日本采用轉(zhuǎn)移酶將多聚葡糖苷引入茶多酚分子的報道。（2）化學(xué)合成修飾Tanaka［30］從兒茶素EGCG出發(fā)將EGCG與過量的硫醇化物反應(yīng)，經(jīng)SephadexLH-20分離得到了一系列的合成產(chǎn)物，如下圖所示，文章從理論上分析了這些衍生物在卵磷脂脂質(zhì)體系中的憎水性能和去自由基能力。圖3Tanaka圖3Tanaka合成產(chǎn)物結(jié)構(gòu)at生物RIR2R31HHH\CH.SC.H,-HH4CH.SCH-jC(1HqHH8ch2scibh37HH9ch2scibhI7scibh，-HIIHHCONHChFT「各衍生物在脂質(zhì)體上的作用方式如圖4所示。EGCG1、衍生物4無法穿過脂質(zhì)雙層，只能清除水溶性的自由基；接上較多羥基鏈的衍生物9，它們的烴基均能穿過脂質(zhì)，深入脂質(zhì)體的憎水區(qū)，清除由憎水自由基啟動子產(chǎn)生的脂溶性自由基；衍生物8則因烴基過長，會造成脂質(zhì)體的聚集、沉淀；3、11則可對兩種自由基都起作用。Water圈4Tanak.^Water圈4Tanak.^成產(chǎn)物在卵瞬脂貫體上的柞用方式liDidb訂ayerL我國的科技工作者主要是采用酰化法獲得脂溶性茶多酚的［31］。先將油溶性脂肪酸(如油酸)與酰化劑(如三氯化磷)反應(yīng)，得到脂肪酰氯，再將純度大于98%的茶多酚與之反應(yīng)生成酯化茶多酚。一般反應(yīng)應(yīng)使脂肪酰氯過量，由于獲得的產(chǎn)物未經(jīng)過NMR、IR驗證，所以實際結(jié)構(gòu)及每種組分的比例無法確定。通過化學(xué)、仿生學(xué)、細胞三個層次對這種酰化產(chǎn)物進行研究表明，改性后的分子脂溶性大大增強分子更容易深入到疏水區(qū)，清除脂溶性自由基能力較強。通過合理的脂肪酰氯和茶多酚的比例，獲得的產(chǎn)品可以做到完全溶解在油相中。急性小鼠灌服毒性試驗，LD50為8000mg/kg。茶多酚的氧酰化法和碳酰化法［32］上面講到，利用化學(xué)合成的方法將茶多酚分子結(jié)構(gòu)的某些部位酰化或酯化，引入油溶性基團從而促進茶多酚在油脂中的溶解性,生產(chǎn)出脂溶性茶多酚(LTP),是目前應(yīng)用最為廣泛的茶多酚改性方法。酚與酸進行酯化時與醇不同，它只是輕微的吸熱反應(yīng)，對平衡不利，故通常采用酸酐或酰氯與多酚作用制備酚醇。在茶多酚的酰化反應(yīng)中包括兩種反應(yīng)可能，即氧酰化法(酰化反應(yīng)發(fā)生在酚羥基上)和碳酰化法(酰化反應(yīng)發(fā)生在芳環(huán)上)。氧酰化法氧酰化法是在茶多酚的酚羥基上引入酰基，從而形成酯。該酯化反應(yīng)是一個親核反應(yīng)。酰化劑羰基上的電子位移使碳上帶有部分正電荷，是一個親電試劑。被酰化物的羥基上具有未共用電子對，因此易于對羰基碳原子發(fā)生親核性攻擊，是一個親核試劑。其反應(yīng)速度和平衡常數(shù)與反應(yīng)物醇(或酚)上的親核性強弱及分子的空間位置有關(guān)，親核性越強，空間位阻越小則反應(yīng)越易進行。而對酰化劑來說，其羰基上陽電荷的大小與脫離基團(在羧酸中為'-OH”，在酰氯中為“-ci”)的負電性大小有關(guān)，即脫離能力越強，碳上的陽電荷增加而使反應(yīng)活性增加，相反如果脫離基團上的電子易于轉(zhuǎn)移，脫離能力減弱，則羰基上的陽電荷減少，其酰化能力就減弱。通常采用的酰化劑為酰氯。其反應(yīng)式可以簡化表示為R-OH+R'COClfR-OCO-R'。目前報道較多的是用化學(xué)試劑對兒茶素進行氧酰化反應(yīng)，較多研究集中在以長碳鏈脂肪酸酰化，制備脂溶性茶多酚(LTP)。這類產(chǎn)品是(-)表兒茶素(EC)、(-)表沒食子兒茶素(EGC)、(-)表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、以及(-)表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的混合物的氧酰化產(chǎn)物。按這類氧酰化反應(yīng)的常規(guī)合成技術(shù)，常用的酰化劑有羧酸、醋酐、酰氯，其酰化能力由強至弱依次為酰氯〉醋酐〉羧酸。一般選擇酰氯作為酰化劑。而制備酰氯通常通過羧基的氯置換反應(yīng)。由于酰氯的氯原子活性很大，因此制備酰氯時，應(yīng)采用活性更大的無機酸酰氯為酰化劑制備試劑。綜合考慮，選擇亞硫酰氯（氯化亞砜作為制備酰氯劑的試劑。現(xiàn)有技術(shù)是茶多酚經(jīng)酰氯氧酰化后，水洗終止反應(yīng)，有機相直接濃縮即得脂溶性茶多酚產(chǎn)品，產(chǎn)品沒有經(jīng)純化，其中含有大量未反應(yīng)的脂肪酰氯，經(jīng)水洗后成脂肪酸，因此其產(chǎn)品中脂溶性茶多酚的實際含量很低，其單位質(zhì)量抗氧化性能當(dāng)然也相應(yīng)降低，且產(chǎn)品工藝條件（包括酰化劑制備及氧酰化反應(yīng)）未經(jīng)針對性篩選，其抗氧化性能也不是最優(yōu)的。基于上述討論，制備脂溶性茶多酚的關(guān)鍵技術(shù)點是反應(yīng)條件的選擇及反應(yīng)物純化方法。碳酰化法酰氯在AlCl3的催化下進攻芳環(huán)，酰基取代了苯環(huán)上的氫原子。這是一個親電取代反應(yīng)。反應(yīng)方程式可以簡化表示為：R-OH+R'COCl-RCOR'-OH。碳酰化法是在茶多酚的苯環(huán)結(jié)構(gòu)上引入酰基，屬于Friedel—Crafts酰基化反應(yīng)，在酰基化中不發(fā)生烴基的重排。在芳核上引入酰基生成芳酮，形成的是碳—碳鍵，具有R-COR型結(jié)構(gòu)的酮類化合物，不損失兒茶素分子中的酚羥基。產(chǎn)品在增加脂溶性能的基礎(chǔ)上，保持原有的抗氧化性能，能溶于油脂及有機溶劑，而不溶于水；其抗氧自由基及抗脂質(zhì)過氧化性能與茶多酚相近。反應(yīng)必須在無水條件下進行。反應(yīng)式及機理如圖5：由于酰基的吸電子效應(yīng)與空間位阻效應(yīng)，使同一個苯環(huán)上難以進行第二次碳酰化，但由于茶多酚分子有多個苯環(huán)結(jié)構(gòu)，因此不同的苯環(huán)可能分別被酯化，形成多酯衍生物。碳酰化反應(yīng)常用的酰化劑為酰氯與醋酐。醋酐雖能與酚羥基反應(yīng)但反應(yīng)溫度較高（茶多酚易在長期高溫被氧化），反應(yīng)副產(chǎn)物較多，且需以吡啶作為催化劑。酰氯反應(yīng)活性強,且是一個不可逆反應(yīng)（酸酐的反應(yīng)是可逆反應(yīng)），因其反應(yīng)其他產(chǎn)物是氣體（HC1）。所以選擇酰氯為酰化劑。催化劑選用Lewis酸中的無水三氯化鋁，因其最為常用，引起催化作用強并且價格便宜，且茶多酚不會與其發(fā)生明顯的副反應(yīng)。因此，本實驗使用三氯化鋁為催化劑。選用硝基苯為反應(yīng)溶劑。改性后脂溶性茶多酚的抗氧化性評價劉建等［33］將茶多酚用于新鮮大豆食用油脂的抗氧化試驗,結(jié)果表明,在大豆油中茶多酚具有明顯的抗氧化作用,特別是改性后的油溶性茶多酚的抗氧化作用更強,并克服了水溶性茶多酚對油脂的色澤及透明度的影響,并具有耐熱性,其抗氧化效果隨添加量的增加和存放