第8章梯度洗脫8-1引言如前所述，等度別離在洗脫全過程中流動相組成不變〔例如50%甲醇-水〕，而在梯度洗脫中流動相組成隨運(yùn)行過程是變化的〔例如5→100%甲醇-水〕。梯度洗脫中一般采用二元〔溶劑〕流動相：A與B，其中強(qiáng)溶劑B的濃度〔%B〕在運(yùn)行過程中逐漸增加。圖8-1所示為幾種不同類型的梯度變化，其中線性梯度最為常用。除另有說明，本書中均假設(shè)為線性梯度。圖8-1所示為流動相組成在20min內(nèi)，B濃度由0增大為100%〔線性梯度，5%/min〕。許多樣品用梯度洗脫會別離更好，但許多實驗室卻對梯度洗脫的應(yīng)用存在很大偏見。其原因有如下幾點：1、有些實驗室尚不具備梯度洗脫設(shè)備。2、梯度洗脫更復(fù)雜，似乎更難進(jìn)行新方法建立與常規(guī)分析。3、某些HPLC檢測器〔如示差折光檢測器〕不能使用梯度洗脫。4、每次運(yùn)行梯度洗脫后需重新平衡色譜柱，耗時較長。5、不同設(shè)備的別離結(jié)果可能不同，所以梯度洗脫法移植時會出現(xiàn)差異。6、梯度洗脫中的基線問題更為普遍，并且必須使用高純?nèi)軇?、某些色譜柱╱流動相的聯(lián)合應(yīng)用不適于梯度洗脫。如權(quán)衡采用梯度洗脫對每一別離的優(yōu)缺點，那么很多別離將只適于使用梯度洗脫。本章中我們將說明梯度洗脫別離實際上與等度洗脫非常相似，因此梯度洗脫的方法建立和日常操作與等度洗脫相比并不太難。在8-5節(jié)中我們將探討上述列舉的梯度洗脫中存在的問題，以及如何防止或減少這些問題的方法。圖8-1不同的梯度形狀下面的討論主要針對反相條件，但是其它HPLC模式的梯度洗脫也遵循相同的原理。我們以目前對梯度洗脫詳盡而全面的理解，可以通過幾次初始實驗的別離情況對以后別離進(jìn)行準(zhǔn)確地預(yù)測〔見10-2-2節(jié)〕。8-2梯度洗脫的應(yīng)用1、具有較寬k值范圍的樣品〔即等度條件下不可能使所有譜峰到達(dá)0.5<k<20〕。2、大分子樣品〔如分子量大于1000，尤其是生物樣品，見第11章〕。3、樣品含有晚流出干擾物，它們會污染色譜柱或在后續(xù)運(yùn)行中流出。4、溶于弱溶劑的樣品稀溶液〔如用反相柱別離的樣品水溶液〕。此外，即使最終有可能使用等度方法，初始實驗采用梯度洗脫往往是HPLC方法建立的最正確起點。8-2-1梯度洗脫用于常規(guī)分析8-2-1-1樣品的保存值范圍選擇梯度洗脫的一般理由是樣品具有較大的保存值范圍。圖8-2所示為二烷基鄰苯二甲酸酯混合物的別離，該同系混合物包括二甲基〔1〕、甲乙基〔2〕、二乙基〔3〕、二正戊基〔9〕鄰苯二甲酸酯，在C8柱上采用不同組成的乙腈-水流動相進(jìn)行別離。50%B的等度別離可以獲得較好別離度[見圖8-2a關(guān)鍵峰對1╱2的Rs=1.5，但運(yùn)行時間較長〔70min〕]；而且，后面譜峰〔8和9〕展寬，難以檢測。采用較強(qiáng)流動相〔65或80%B；圖8-2b和c〕可使運(yùn)行時間縮短，峰8和9變窄，有利于檢測和定量。然而，前面譜峰1~4的別離效果變得很差〔關(guān)鍵峰對的Rs<0.8〕。由于前面譜峰需用較弱流動相〔如50%B〕，而后面譜峰需用較強(qiáng)流動相〔如80%B〕，所以該樣品采用等度條件別離不夠理想。圖8-2二烷基鄰苯二甲酸酯同系物的反相HPLC別離樣品峰為C2〔二甲基，1號峰〕至C10〔二正戊基，9號峰〕；25×0.46cm5μmC8柱，乙腈〔B〕-水流動相；2.0ml/min；600C。該樣品采用梯度洗脫那么別離很好〔見圖8-2d〕：10min梯度，20→100%B。所有峰均很好地別離〔關(guān)鍵峰對1╱2的Rs=1.5〕，運(yùn)行時間僅11min，所有譜峰都很窄，利于檢測及準(zhǔn)確定量。對于保存值范圍較寬的樣品，梯度洗脫顯然是良好的選擇。采用梯度洗脫的另一個原因是：在等度洗脫條件下，k>20的晚流出峰往往會出現(xiàn)較嚴(yán)重拖尾，如圖8-3a中羧酸混合物的離子交換別離。而采用梯度洗脫的同一樣品〔圖8-3b〕，色譜圖中最末峰仍較窄，峰形也很好，前面譜峰的別離得以改善。然而應(yīng)注意，梯度洗脫并不能解決所有譜峰的拖尾問題。圖8-3離子交換色譜別離芳香羧酸混合物〔a〕55mM硝酸鈉水溶液流動相的等度別離；〔b〕10→100mM硝酸鈉水溶液流動相的梯度洗脫。8-2-1-2大分子樣品組分大分子量樣品〔肽、蛋白質(zhì)、合成聚合物等〕一般采用梯度洗脫別離會更好，尤其用反相別離條件時。這類樣品的等度保存往往對于流動相組成〔%B〕的微小改變極其敏感，難以將保存值控制在適宜的范圍內(nèi)。例如丙醇-水流動相等度RPC別離碳酸酐酶〔一種分子量29000Da的蛋白質(zhì)〕時，僅改變±0.1%B，那么會導(dǎo)致保存時間±20%的變化。當(dāng)用梯度洗脫代替等度條件時，HPLC別離大分子時也會使峰形有較大改善。8-2-1-3晚流出組分有些樣品采用等度洗脫可很好地別離〔有關(guān)譜峰到達(dá)0.5<k<20〕，但所含有的晚流出干擾組分會污染色譜柱或?qū)罄m(xù)別離產(chǎn)生干擾。圖8-4a所示為對單一化合物〔標(biāo)有EP的陰影峰〕定量的等度別離，但晚流出的干擾峰仍連綿不斷。而梯度洗脫可以通過在下一次進(jìn)樣前將這些晚流出峰快速洗脫出。圖8-4b所示為梯度別離木漿提取物中蒽醌的結(jié)果。其中寬且保存嚴(yán)重組分〔箭頭所指〕在等度條件下未能流出，所以首次采用等度洗脫別離這些木漿提取物，即由于強(qiáng)保存化合物滯留在色譜柱上，使色譜柱活性迅速喪失，不能到達(dá)充分別離。而改用梯度洗脫后，每次運(yùn)行過程中均可除去強(qiáng)保存組分，此問題便迎刃而解。圖8-4含晚流出物的樣品是梯度洗脫的良好候選〔a〕等度反相分析藥物EP的血漿提取物〔b〕反相梯度洗脫分析木漿提取物中的蒽醌8-2-1-4增強(qiáng)檢測靈敏度在等度洗脫中可通過增大%B，以降低k值和峰寬來提高檢測靈敏度〔見式2-15〕。但是，因為t0附近的干擾峰和基線波動，使該方法的應(yīng)用常受到限制。而在梯度洗脫中，采用陡梯度通常具有等度別離相同的優(yōu)點〔k<2〕，且可防止等度洗脫中的這類干擾〔見圖8-5a與b，首峰以星號標(biāo)記〕。梯度洗脫可增強(qiáng)檢測，與相應(yīng)的等度洗脫別離比擬，樣品峰變窄約2倍〔且峰高增大2倍〕。8-2-1-5稀樣品溶液對于溶解于弱溶劑中的稀樣品，梯度洗脫可以采用大體積進(jìn)樣，而不會引起峰展寬。在這種條件下，樣品在進(jìn)樣過程中于柱入口處完成柱上濃縮，因此可以大體積〔如1~10ml〕進(jìn)樣。等度洗脫也可以進(jìn)行相似的柱上濃縮，但是由于進(jìn)樣過程中樣品與流動相的混合，使樣品體積過大，引起樣品峰嚴(yán)重展寬〔梯度洗脫在樣品進(jìn)樣時僅與弱溶劑A混合，而不是較強(qiáng)的等度流動相〕。梯度洗脫不可能適用于每種情況。在流動相中使用強(qiáng)保存添加劑〔如胺改性劑，疏水離子對試劑〕會使梯度洗脫復(fù)雜化，由于柱再生變慢，別離重現(xiàn)性下降。因為許多極性溶劑〔如硅膠作為柱填料時的丙醇〕的保存極強(qiáng)，用非鍵合硅膠柱的正相別離也有相似問題；見6-8-4-1節(jié)中的“溶劑分層〞。8-2-1-6梯度洗脫的替代法有時，即使樣品保存值范圍超出0.5<k<20，仍是采用等度洗脫較好。用極性較強(qiáng)的反相柱〔如氰基柱〕通常可以縮小保存值范圍。極性的弱保存組分易與強(qiáng)極性固定相發(fā)生作用，而非極性組分與其作用較弱。圖6-11為該現(xiàn)象的例如。也有研究說明采用THF作強(qiáng)溶劑時，能比含甲醇或乙腈的流動相減小保存值范圍。對于某些樣品，通過柱切換〔見4-6節(jié)〕代替梯度洗脫也很方便。8-2-2梯度洗脫用于方法建立當(dāng)對組成未知的樣品進(jìn)行HPLC方法建立時，即使最終別離擬用等度洗脫首先采用梯度洗脫實驗仍有以下益處：1初始別離用梯度洗脫可以近似估計出樣品的保存值范圍，為后續(xù)實驗應(yīng)該選用等度或梯度洗脫提供必要的依據(jù)。通過最初的梯度別離可識別那些不適于反相HPLC的保存極弱或極強(qiáng)的樣品〔見圖9-1c，d和相關(guān)的討論〕。2假設(shè)等度洗脫是較好選擇，初始梯度實驗可為進(jìn)一步實驗提供最正確%B的估計值。假設(shè)梯度洗脫更適宜，那么初始實驗可為下一步的梯度洗脫估計出開始和終止%B的最正確值；見圖8-6，表8-1~8-3及相關(guān)的討論。3初始梯度洗脫實驗可以使整體樣品別離更好、更快〔與等度別離相比〕，對方法建立極為有利〔見圖8-3〕；初始實驗中能別離出的峰數(shù)越多越好。4初始梯度實驗遺漏早與晚流出的低濃度組分的可能性不大；如圖8-5中假想的別離，其中標(biāo)有星號的被測物峰，在等度洗脫中很可能被遺漏。圖8-5樣品初始用等度及梯度洗脫的別離星號標(biāo)出早和晚流出的小峰應(yīng)用初始梯度實驗以指導(dǎo)進(jìn)一步的HPLC方法建立見圖8-6a。較好的梯度條件為：15×0.46cm柱，5→100%乙腈，梯度時間tG=60min，流速2.0ml/min〔采用其它柱長，流速也可以〕。假設(shè)初始實驗中大局部樣品峰擁擠于t0附近，那么樣品親水性太強(qiáng)，不適合反相別離。假設(shè)譜圖中未出現(xiàn)樣品峰，或者因檢測器響應(yīng)較差〔見第3章〕或者樣品疏水性太強(qiáng)，也不適合反相別離。無論哪一種情況，均需采用其它別離模式；見圖9-1c與d的例如與討論。8-2-2-1用等度還是梯度別離如圖8-6a的色譜圖所示，最早流出峰晚于2倍t0，晚流出峰早于梯度結(jié)束，說明反相HPLC適于該樣品。下一步那么需考慮采用梯度還是等度洗脫方式最適宜。可以通過譜圖中標(biāo)出的初峰和末峰的保存時間〔圖8-6a中的tRa和tRz〕確定。如果我們限度保存時間差ΔtR=tRa-tRz，那么比值ΔtR╱tG可以決定等度別離是否可行。最大允許k值范圍為0.5<k<20，此時ΔtR╱tG應(yīng)小于0.40，也就是說，該樣品保存值范圍應(yīng)小于梯度時間的40%。表8-1根據(jù)tRa觀測值，方便、準(zhǔn)確地總結(jié)了〔等度洗脫〕tRz的允許值。圖8-6a中，首峰和末峰的保存時間分別為9.5min和24.5min〔ΔtR╱tG=0.25〕。由表8-1和首峰9.5min的保存時間，只要末峰保存時間小于32min，等度洗脫即可行。圖8-6a的樣品即為這種情況：可以進(jìn)行等度洗脫。圖8-6HPLC方法建立中初始梯度洗脫的應(yīng)用取代苯胺樣品；條件：15×0.46cm柱；2.0ml/min；350C。表8-1基于初始梯度實驗確定等度別離是否可行atRa〔min〕b如下k值范圍內(nèi)允許的tRz值〔min〕b1<k<100.5<k<20<1.5CC281731221414245162671929102333152938203544254049304554355059405564>40dd不確定度e±3min±5mina見圖8-6a，條件15×0.46cm柱，60min梯度，5→100%ACN–水，2.0ml/min；當(dāng)不能確定是否需要梯度洗脫時，推薦采用這些條件；btRa=別離中首峰的保存時間，tRz=別離中末峰的保存時間；c反相別離中樣品可能保存缺乏；見9-2-2-3節(jié)d反相別離中樣品可能保存太強(qiáng)；見9-2-2-3節(jié)e估計這些值的不確定度即使有時等度洗脫可行〔因為0.5<k<20〕，但用梯度洗脫或許會更好。在6-3-1節(jié)中，我們曾指出改變%B〔相當(dāng)于改變k值〕會使選擇性發(fā)生改變，因此對某些樣品而言，到達(dá)充分別離可能更容易。但是，當(dāng)樣品k值范圍較大〔如kz╱ka>20，ka和kz分別為首峰a與末峰z的等度k值〕，即使%B改變很小，也會導(dǎo)致一些峰超出0.5<k<20的范圍。這即意味著由于所允許的%B變化有限，通過改變%B值，不能使樣品別離度改變很大。此時采用梯度洗脫代替等度〔為改變k和α〕，通過改變梯度變化速率而不是%B，可使選擇性發(fā)生很大變化〔見8-3-2節(jié)〕。只要ΔtR╱tG>0.15時，最好采用梯度洗脫〔改變k值和α〕。8-2-2-2估計最正確等度條件如果圖8-6a中的實驗說明采用等度條件較好，下次〔等度〕實驗的最正確%B值那么可由表8-2確定。梯度別離中末峰的保存時間tRz可用于估計最正確%B值，該值在樣品的等度別離中可使末峰的k值較理想。例如圖8-6a，tRz=24min，由表8-2可知15×0.46cm柱，流速2.0ml/min，梯度時間60min，末峰k=10時，預(yù)測的流動相組成為37%B。圖8-6b為該樣品實際的等度別離〔37%B〕結(jié)果。如所期望，該別離的k范圍可以接受〔2<k<10〕。表8-2由梯度洗脫中末峰保存時間tRz估計出的等度運(yùn)行的%B〔ACN〕值tRz〔min〕等度運(yùn)行中末峰k值對應(yīng)的%B估計值K=5K=10K=20560-101912515292214203730222545383030534638356154464069625445777062508578705593867860100948665-10094條件：15×0.46cm柱，60min梯度，5→100%ACN，2.0ml/min。8-2-2-3估計最正確梯度條件如果表8-1實驗說明樣品更適于梯度條件，可由表8-3估計分子量小于2000Da樣品的初始和終止%B的最正確值。例如，1分子量低于2000Da樣品，假設(shè)首峰的保存時間為10min，末峰為40min，由表8-3可知推薦的初始%B為11%、終止%B為68%。中選好最終梯度條件后，這些%B值仍應(yīng)照8-4-1節(jié)的討論作進(jìn)一步調(diào)整。表8-3基于初始梯度運(yùn)行中的首峰〔a〕、末峰〔z〕的保存時間tR，估計梯度洗脫的起始和終止%BatRa或tRzb〔min〕起始%B終止%Bb，c5314101122151930202738253546304354355160405968456776507584558310060d--a見圖8-6，條件：15×0.46cm柱，60min梯度，5→100%ACN，2.0ml/min。b首峰a〔起始%B〕或末峰z〔終止%B〕的保存時間c對于變化速率大的梯度，%B〔終止〕必須增加〔高達(dá)35%〕d可能需用正相或非水反相HPLC〔見9-2-2-3節(jié)〕。8-3梯度洗脫的原理梯度洗脫中，流動相強(qiáng)度〔%B〕在別離過程中逐漸增加。也就是說隨樣品遷移過色譜柱中，以k衡量的樣品各譜峰的保存值是最小的。見圖8-7中的假想k變化曲線。其中假設(shè)譜峰X是流出的第一樣品峰，譜峰z是末峰。首先考慮峰X的行為，標(biāo)有“X〞的實曲線表示該譜峰從柱入口〔0，0〕到柱出口〔1，0〕的遷移分?jǐn)?shù)。別離開始時，%B較低，峰X的k值較大。因此初始譜峰X仍停留于柱入口附近〔很少或尚未遷移〕。然而一段時間后，%B值的增加使譜峰X的k值達(dá)足夠小〔k<10〕，以使其開始在柱內(nèi)移動。圖8-7中標(biāo)有“k〔X〕〞的虛曲線表示峰X在別離過程中不同時刻的k值。隨著時間的增加，峰X的k值繼續(xù)下降，X的遷移越來越快。最后，在該峰的保存時間tx時，X到達(dá)柱出口，被檢測器檢出，在色譜圖中被記錄一個峰。圖8-7梯度洗脫過程中的峰遷移上圖：實線為峰遷移；虛線為k的即時值。詳情見下文。等度洗脫中每個峰的k值對于理解與控制HPLC的別離條件都非常重要。在梯度洗脫中k也同樣重要。圖8-7中X的k值有多大？答案很簡單：梯度洗脫的有效k值等于譜峰在柱上遷移至一半路程時的k值。圖8-7中的譜峰X見上點線，當(dāng)峰在柱中遷移一半時的近似值k=2〔下點線〕。梯度洗脫中k的平均值定義為k*，與等度別離一樣，它決定樣品的別離度和峰寬〔見式2-3和2-15〕。從圖8-7也可以看到末峰z在柱入口端停留很長時間，但最終流動相變得足夠強(qiáng)，即k<10。峰z以與首峰同樣的方式遷移，并在保存時間tz時流出，其有效k值〔k*〕也等于2。不同峰的k*近似為常數(shù)值是反相線性梯度別離〔如圖8-7〕的主要特征。因此，線性梯度色譜圖中每一譜峰具有相似的峰寬，并且不像等度洗脫中常見的那樣，開始時樣品的別離度較差〔見圖8-2和8-3〕。8-3-1梯度與等度洗脫等度別離中的每個譜峰在穿過色譜柱的過程中，被組成恒定不變的流動相〔%B〕所包圍，由容量因子k衡量的某一譜峰的保存值在別離過程中保持不變。但在梯度洗脫中，一譜峰在穿過色譜柱的過程中周圍的流動相是改變的，該譜峰的即時k值也是在變化的。另外，等度色譜圖中被別離的譜峰通常具有不同的k值，而在梯度洗脫中不同譜峰的有效k值〔k*〕卻幾乎相同。當(dāng)梯度洗脫中2相鄰譜峰的平均k*值與等度別離中的相同時〔其它條件不變〕，等度和梯度別離中該2個譜峰的別離度也將類似。梯度洗脫中的k*值可通過實驗條件進(jìn)行估計：梯度時間tG〔min〕，流速F〔ml/min〕，柱死體積Vm〔ml，見式2-6〕，初始和最終%B的差值〔Δ%B〕以及樣品化合物的性質(zhì)S〔見式8-1〕。k*=87×tG×F╱[Vm×〔Δ%B〕×S]〔8-1〕式8-1用于色譜圖中洗脫時間不很短的譜峰〔在等度與“半等度〞條件下〕。對于任何峰，洗脫時的k值可由下式得出：k=1╱[〔2╱k*〕＋〔1╱k0〕]〔8-1a〕其中k*由式8-1計算帶入，k0是梯度開始時的k值。對于分子量100~500Da的樣品，S≈4，式8-1可近似為：k*=20×tG×F╱[Vm×〔Δ%B〕]〔8-2〕大分子的S值可以為10~100不等，這說明變化速率低的梯度適于這類樣品；梯度變化速率低〔%╱min值較小，%╱min=Δ%B/tG〕補(bǔ)償了較大S值對k*影響〔見式8-1〕詳見11-2-1-1節(jié)的討論。梯度變化速率對k*和別離效果的影響可由校正的梯度變化速率參數(shù)Gs〔correctedgradientsteepnessparameter〕來估算：Gs=Vm×〔Δ%B〕╱〔tG×F〕〔8-2a〕式8-2可改寫為k*≈20╱Gs〔8-2b〕Gs為由〔%B/min〕柱死體積除以流速測得的校正梯度變化速率；也等于單位柱體積的流動相中%B的變化。只要流速和柱尺寸不變，梯度變化速率的測定結(jié)果〔%/min=Δ%B/tG〕可用于描述由于梯度變化速率的改變引起的別離結(jié)果變化。當(dāng)流速或柱長改變時，Gs在研究柱條件〔柱長與流速〕對別離的影響時的重要性將在8-4-3節(jié)中進(jìn)一步探討。理想的k*值可通過選擇適宜的實驗條件得到。梯度變化速率通常以%/min表示，故式8-2還可表示為：k*≈20×〔F╱Vm〕╱〔%/min〕〔8-3〕注意，柱型和流速相同時，如梯度變化速率〔%/min〕下降，k*值變大。假設(shè)某一樣品需用梯度洗脫，選擇k*≈5進(jìn)行初始實驗較為適宜，這樣可以兼顧別離度Rs、能方便檢測的峰高和運(yùn)行時間〔見2-3-1節(jié)〕。圖8-6a〔及表8-1與8-2〕為采用較大k*值〔k*≈17〕的例如。當(dāng)其它條件等同時，大k*值需要較長的運(yùn)行時間〔tG值較大〕，但可使整體別離度有所增加，尤其是有可能用等度別離時〔0.5<k<20〕更適于后續(xù)的RPC方法建立。8-3-2梯度變化速率的影響由于等度與梯度洗脫的相似性，較大k*值的影響應(yīng)與較大k值一樣：〔1〕k*增加，別離度Rs開始先增加，然后到達(dá)平衡；〔2〕譜峰伴隨峰高相應(yīng)減小而展寬；〔3〕運(yùn)行時間延長。該說明見圖8-8中15種組分的除莠劑混合物的別離，梯度時間從5min增加至100min，k*從0.7〔5min〕升至14〔100min〕。當(dāng)梯度變化速率從20%/min降至5%/min再降至1%/min時，可清晰別離的峰數(shù)由9個增至14~15個。別離度隨梯度變化速率降低〔或增加梯度時間〕的這種增加，以峰高降低〔峰展寬〕和運(yùn)行時間增加為代價，正如等度洗脫中%B的降低時一樣。梯度和等度洗脫中的這些規(guī)律簡單比照方下：%/min〔梯度〕的增加類似于%B〔等度〕的增加梯度k*的增加〔見式8-2或8-3〕類似于等度k的增加圖8-8一種除莠劑樣品的梯度別離與梯度時間或梯度變化速率的關(guān)系樣品：9種苯基脲與6種三嗪的混合物。條件：25×0.46cm10μmC18柱；甲醇-水梯度如圖示；1.7ml/min；室溫。箭頭所指為色譜圖中的最后3個譜峰。一旦理解了等度洗脫與梯度洗脫的相似性，梯度洗脫的方法建立幾乎同等度別離一樣。首先優(yōu)化保存值〔k*〕，然后按需要改變選擇性〔α〕，最后可調(diào)節(jié)柱條件〔N〕以兼顧改善運(yùn)行時間和別離度。進(jìn)一步探討見8-4節(jié)〔亦見9-5節(jié)〕。8-3-3梯度范圍的影響梯度范圍指梯度起始和終止%B的差值。初始的試探性實驗可進(jìn)行一次全范圍梯度〔即5→100%B〕。有些C8或C18柱對不含有機(jī)溶劑的水潤濕性很差；每次運(yùn)行之間需重新進(jìn)行柱平衡〔見8-5-2節(jié)〕。甚至有報道稱色譜柱采用100%水作流動相后，會“顯著地降低使用壽命〞，這些問題可用5%B以上開始梯度加以防止；此處“全范圍梯度〞可理解為0→100%B或5→100%B。全范圍梯度通常較費(fèi)時，故在方法建立期間應(yīng)調(diào)整起始和終止%B值。圖8-8的例如用于圖8-9和圖8-10，以說明梯度范圍對別離的影響。圖8-9一種除莠劑樣品的梯度別離與初始流動相組成〔%B〕的關(guān)系梯度變化速率2%╱min；其它條件同圖8-8。圖8-9a所示為以2%╱min的全范圍梯度別離除莠劑樣品的例如。第一譜峰的保存時間長達(dá)19min〔浪費(fèi)時間！〕，說明應(yīng)增大初始%B值。當(dāng)初始%B增至40%，并保持同樣的2%╱min梯度時〔見圖8-9b〕，梯度時間由50min減至30min，但色譜圖改變很小〔只是所有峰保存時間均有所減小〕。色譜圖中關(guān)鍵峰對在2次運(yùn)行中的別離度大致相同：圖8-9a中Rs=1.1，圖8-9b中Rs=1.0。當(dāng)初始流動相組成變?yōu)?0%B〔圖8-9c〕時，別離度明顯下降〔關(guān)鍵峰對的Rs=0.7〕，同時色譜圖的前部普遍被壓縮。說明盡管該實驗可將梯度時間進(jìn)一步縮短至20min，但60%的初始%B值過大。圖8-9d的最終實驗〔初始%B=50%〕合理地兼顧了該樣品的別離度〔Rs=0.9〕和運(yùn)行時間。注意圖8-9c中，當(dāng)初始%B值增加超過某一數(shù)值，色譜圖中前部譜峰的間距〔與別離度〕那么會降低，而后面的峰間距仍保持不變。足夠大的初始%B值主要影響色譜圖中的前部譜峰，使它們的k*值降低〔見式8-1a，k0小〕；峰變窄；別離度降低。就初始%B值而言，圖8-9d的別離認(rèn)為是最正確。然而末峰在27min梯度結(jié)束之前經(jīng)18min流出〔見圖8-10a中的箭頭；譜圖同圖8-9d〕。注意，梯度時間為25min，但梯度完成需27min，這是由于柱死體積〔Vm〕的影響。末峰至梯度結(jié)束之間的9min間隙是多余的；梯度〔和別離〕可以在18min結(jié)束。通過保持2%╱min的梯度變化速率，在18min〔80%B〕結(jié)束梯度即可；見圖8-10b。該別離說明初始〔50%B〕和終止〔80%B〕流動相組成為最正確選擇。圖8-10一種除莠劑樣品的梯度別離與最終流動相組成〔%B〕的關(guān)系梯度變化速率2%╱min；其它條件同圖8-8。如梯度過早結(jié)束〔末峰離開柱之前〕，通常應(yīng)增加運(yùn)行時間，并使后面譜峰變寬〔檢測靈敏度下降〕。圖8-10c和d，終止%B值分別為70和60%。圖8-10b的實驗經(jīng)過18min完成，此時可為下一運(yùn)行開始柱平衡，圖8-10c和d完成運(yùn)行分別需要26和70min。顯然，不希望在樣品末峰流出之前結(jié)束梯度。8-3-4梯度形狀的影響如前所示，大多數(shù)梯度別離采用線性梯度。線性梯度易于優(yōu)化，應(yīng)該用于方法建立的初試階段。然而，非線性梯度有時可適當(dāng)?shù)馗纳苿e離：1同系物或低聚樣品，這類樣品的別離度一般隨化合物分子量和保存值的增大而降低。2色譜圖中有些區(qū)域具有大量重疊峰或少數(shù)峰間距較大3色譜圖中不同區(qū)域用變化速率不同的梯度時選擇性最正確優(yōu)化梯度形狀可能需要數(shù)次實驗，非線性梯度的潛在優(yōu)勢通常并不顯著。當(dāng)能方便快捷地采用計算機(jī)模擬選擇最正確條件時，采用非線性梯度會更有意義〔見10-2-2節(jié)〕。8-3-4-1同系物或低聚樣品這些樣品采用梯度別離時，后面組分的峰間距往往會減小。見圖8-11a中聚苯乙烯樣品別離的例如。雖然二聚物~四聚物譜峰可以到達(dá)基線別離，而后面譜峰的別離卻越來越差。圖8-11b中采用凸型梯度說明這些樣品譜峰的峰間距更均勻一致。較陡的初始梯度使k*減小〔見式8-3〕，也使別離度及保存時間降低，而以后陡度較小的梯度又使k*、別離度及相對保存值增大。其最后結(jié)果如圖8-11b，在大致相同的運(yùn)行時間中，使整體別離效果略有改善。如圖8-11b中的曲線梯度會使此類樣品中所有譜峰的別離度均等。圖8-11低分子量聚苯乙烯低聚物的梯度洗脫別離條件如圖示：〔a〕線性梯度；〔b〕凹形梯度。樣品：25μ15%聚苯乙烯600MW〔THF〕；溶劑：30min，40→80%；4號梯度曲線，2ml╱min；色譜柱：μ-BonapakC183.9mm×30cm；檢測器：440型254nm；圖8-11中的低聚樣品的進(jìn)一步研究已有報道。已經(jīng)證明分段梯度〔如圖8-1〕也能如曲線梯度那樣，使這類樣品的別離得到相同的改善。只需2段梯度，并且為使別離效果最正確，每段梯度的速度變化都必須進(jìn)行優(yōu)化〔使第二段陡度較小〕。初始%B的選擇對獲得均勻的峰間距也很關(guān)鍵。分段梯度的主要優(yōu)點是更易于系統(tǒng)地進(jìn)行優(yōu)化。對于這種梯度方式以及其它非線性梯度的應(yīng)用，我們建議最好在試驗曲線梯度之前先試用分段梯度。8-3-4-2含組峰的色譜圖這種情況也說明采用非線性梯度是使樣品別離度均等的一種手段。即較陡的梯度可用于色譜圖峰別離寬闊的局部〔以節(jié)省時間〕，而較平坦的梯度可用于色譜圖峰重疊擁擠的局部〔以提高別離度〕。見圖8-22中22種肽樣品的梯度別離。圖8-12a中，線性梯度變化速率〔0→47%B〕已調(diào)整至〔0.63%B/min〕，使關(guān)鍵峰對9╱10，11╱12和14╱15獲得最正確峰間距和最大別離度〔見8-4-2節(jié)〕。所得別離足夠〔Rs=1.3〕，但運(yùn)行時間有些長〔75min〕。然而，如圖8-12a所示，峰15〔約48min〕以后的眾峰別離間距過大，說明這局部樣品可用更陡的梯度別離，以縮短運(yùn)行時間。通過保持原最正確梯度至峰1~15流出，然后增加梯度變化速率以使剩余樣品快速流出。從而到達(dá)這種縮短運(yùn)行時間，而不損失樣品別離度〔Rs=1.3〕的目的〔圖8-12b〕。這樣，運(yùn)行時間縮短至53min，節(jié)省時間30%。用非線性梯度進(jìn)一步控制選擇性，詳見圖8-13d的說明〔見8-4-2節(jié)〕。8-4建立梯度別離梯度洗脫的方法建立可以通過與等度別離的系統(tǒng)方式同樣的步驟進(jìn)行，因此，已經(jīng)證明的等度方法建立策略的優(yōu)點也可同樣適用于梯度洗脫。梯度方法建立的步驟可總結(jié)為：1以等度別離的相同方式選擇初始條件：色譜柱，流動相組成，流速，溫度等〔見表1-3〕；等度方法建立能以強(qiáng)流動相開始〔80~100%B〕，但首次梯度試驗卻應(yīng)采用較寬的梯度范圍〔如5→100%B〕。應(yīng)先優(yōu)化初次實驗的k*〔如k*>2，式8-2〕，梯度變化速率不能太陡。2再調(diào)節(jié)梯度范圍以縮短運(yùn)行時間，去除色譜圖開始和結(jié)束時無用的空間。3如出現(xiàn)譜峰重疊或運(yùn)行時間太長，那么需改變選擇性〔α〕。4〔作為備選〕考慮采用非線性梯度方式，以進(jìn)一步改善別離。5優(yōu)化峰間距后，改變柱條件以改善別離度和╱或運(yùn)行時間。6制定平衡柱的最正確方法，并考察儀器差異對別離的影響〔見8-5-1節(jié)〕。圖8-1222組分肽樣品〔重組人生長激素胰蛋白酶水解液〕的梯度別離條件：15×0.46cmC18柱；乙腈-水梯度，含0.1%三氟醋酸；400C，1.0ml/min。〔a〕74min梯度，0→47%B；〔b〕0╱48╱56min分段梯度，2：32：47%B。8-4-1選擇梯度條件圖8-8~8-10所示為選擇優(yōu)化梯度條件的重要步驟。這些實驗類似于等度別離中為控制k值調(diào)整%B的試-湊方法。8-4-1-1梯度變化速率初始選擇梯度變化速率〔如圖8-8〕之前應(yīng)先估計那些能使所有樣品峰k*>2的實驗條件〔式8-2〕。如已確定最終方法采用梯度洗脫，k*≈5是良好的首選。色譜柱〔以及其Vm值〕和流速應(yīng)在進(jìn)行初次梯度別離之前選定；選擇15×0.46cm、5μmC8柱或C18柱、流速2.0ml/min較好。通常，初次別離宜用全范圍梯度：[如5→100%B〔Δ%B=95〕]。因此，式8-2中未特殊標(biāo)記的唯一變量為梯度時間tG〔式8-2假設(shè)S≈4〕。解式8-2可得到：tG=25×Vm╱F〔5→100%B〕〔8-4〕例如，對于15×0.46cm柱，Vm≈0.1×10=1.5ml〔見式2-7〕。如流速為2.0ml/min，tG的推薦值為25×1.5╱2=19min。8-4-1-2梯度范圍如初始梯度實驗采用表8-2中的條件進(jìn)行〔60min梯度，5→100%B；15×0.46cm柱；2.0ml╱min；k*≈17〕，起始%B與終止%B的最正確值可由表8-3估計出。然后可采用20min梯度〔k*≈5〕，如圖8-9與8-10通過“試-湊〞實驗，進(jìn)一步優(yōu)化梯度范圍。如初始運(yùn)行之前已確定需用梯度洗脫，小分子〔<2000Da〕最好先采用20min梯度實驗。8-4-1-3梯度形狀圖8-10b的別離對梯度范圍和變化速率進(jìn)行了初步優(yōu)化。下面，應(yīng)考察非線性〔即分段〕梯度能否進(jìn)一步改善別離效果。例如，圖中盡管未出現(xiàn)色譜圖中某些區(qū)域峰過于擁擠，而另一些區(qū)域相對空曠的情況，但該別離的別離度非常勉強(qiáng)；方法建立的下一步應(yīng)考察別離條件，以改善峰間距〔通過分段梯度可能奏效，見8-4-2-1節(jié)〕。8-4-2改變峰間距在梯度洗脫中改變選擇性與峰間距可通過與等度別離相同的方式實現(xiàn)[即通過改變k或k*〔等度洗脫的%B、梯度洗脫的梯度變化速率〕，溶劑類型，色譜柱型，pH，HPLC方法，溫度等]。選擇哪種條件先進(jìn)行研究，決定于與第2、6與7章中等度HPLC討論的相同考慮。盡管這里探討的是反相梯度洗脫，但其它HPLC模式可以采用相同的策略與步驟。反相別離中性樣品時，用于改變選擇性的變量的優(yōu)先次序排列為：首先是流動相強(qiáng)度〔k*〕，其次是溶劑類型〔乙腈>甲醇>THF〕，柱型〔C8或C18柱>氰基>苯基〕，最后是溫度。對于離子樣品，pH和溫度是控制選擇性的重要因素。在梯度洗脫中改變離子對試劑濃度對于離子樣品別離的選擇性改變也有效。然而由于在梯度過程中柱吸附試劑時平衡緩慢，應(yīng)防止用離子對梯度洗脫。關(guān)于離子對梯度洗脫所需的平衡體積，一些研究說明，低疏水性離子對試劑〔如C8-或更小的磺酸鹽〕采用5~10倍柱體積的流動相已足夠；但對于C12-磺酸鹽那么需更長的時間。8-4-2-1梯度變化速率在等度別離中改變%B可使k和α發(fā)生變化；在梯度洗脫中，可通過改變梯度變化速率Gs〔見式8-2〕到達(dá)相當(dāng)?shù)男Ч哺淖僰*和α〕。在等度洗脫中，樣品的k范圍限制了k變化，難以將選擇性控制在較小范圍內(nèi)。例如，如2<k<10，k減少的倍數(shù)不大于4〔k=0.5〕，增加的倍數(shù)也不能大于2〔k=20〕，因此，對于此樣品，k值至多可改變8倍〔4×2〕。在梯度洗脫情況下，k*〔對所以譜峰大致相同〕可在0.5~20之間改變，或者說可改變40倍，這說明在梯度洗脫中改變梯度變化速率〔或k*〕導(dǎo)致α和峰間距的改變可能要比在等度別離中改變%B〔k〕大得多。另外，通過采用分段梯度，可對色譜圖中不同局部的k*進(jìn)行優(yōu)化，以使整體選擇性和別離度到達(dá)最大。因此，通過改變k或k*來控制峰間距在梯度洗脫中比在等度別離中有效得多。有些樣品在梯度變化速率改變時峰間距會有顯著的變化，有些那么很小。圖8-8中的除莠劑樣品在梯度變化速率改變時，其選擇性改變并不大。而圖8-13中的16組分的多環(huán)芳烴〔PAH〕那么是一個峰間距隨梯度變化速率變化的良好例如。對于7min的梯度時間〔圖8-13a，8.6%╱min〕，關(guān)鍵峰對為3╱4〔標(biāo)有星號〕，其別離度Rs=1.0。當(dāng)梯度時間增加至20min〔圖8-13b，3%╱min〕，譜峰對3╱4的別離度增加〔Rs=1.5〕與所期望的平坦梯度情況相吻合。但此時關(guān)鍵峰對為14╱15〔標(biāo)有星號者〕，Rs=0.9。因此，平坦梯度時譜峰3和4的別離最正確，而峰14和15那么更適于較陡梯度。在等度洗脫中，關(guān)鍵峰對發(fā)生改變的2份色譜圖〔條件改變時〕說明中間條件可使整體別離最正確〔關(guān)鍵峰對的Rs最大〕。圖8-13中梯度洗脫的情況也是如此。中間的梯度時間〔圖8-13c中的12.5min〕使關(guān)鍵峰對3╱4和14╱15的別離度更大：Rs=1.4，這一別離效果明顯優(yōu)于圖8-13a或b。在改變梯度變化速率時，好多樣品的峰間距會發(fā)生變化，類似于圖8-13的情況；類似的等度例如〔見6-3-1，7-3-2-2與7-4-4-1節(jié)〕進(jìn)一步支持這一結(jié)論。最后，在梯度洗脫中，改變梯度變化速率通常是改變選擇性最有效的方法。故應(yīng)在探討其它改變選擇性的條件之前，先行試驗。圖8-13色譜圖中先后出現(xiàn)的2對關(guān)鍵譜峰，說明使用分段梯度可使選擇性進(jìn)一步改善。初始的平坦梯度可用于優(yōu)化譜峰對3╱4的別離，而后面較陡的梯度可用于優(yōu)化譜峰對14╱15的別離。圖8-13d中的別離說明在幾乎相同的運(yùn)行時間內(nèi)別離度有了進(jìn)一步的增加〔Rs=1.7，圖8-13c中為1.4〕。由于優(yōu)化梯度變化速率和形狀，圖8-13b〔Rs=0.9，運(yùn)行時間18min〕與圖8-13d〔Rs=1.7，運(yùn)行時間13min〕相比，使別離發(fā)生如此大的改善是值得注意的。圖8-13多環(huán)芳烴樣品的梯度別離與梯度變化速率的關(guān)系樣品：由萘至茚并芘的16種化合物。條件：15×0.46cmSupelcoLC-PAH〔反相〕柱；乙腈-水梯度；2.0ml╱min；350C。圖8-13d中的分段梯度對于其它情況是否有效，取決于樣品分子量和色譜圖中2對或多對關(guān)鍵峰的相對位置。當(dāng)關(guān)鍵峰對緊挨在一起時，分段梯度不很有效，尤其對于分子量低于1000Da的樣品。在為了改善選擇性和別離度而進(jìn)行分段梯度方法建立之前，必須首先了解不同梯度變化速率情況下，2對或多對關(guān)鍵峰的最大別離度。此時，應(yīng)選擇適宜的初始分段梯度，以使先流出關(guān)鍵峰對的別離度較好。在此峰對即將離開色譜柱時，改變梯度變化速率以使下一對關(guān)鍵峰也獲得適宜的別離度〔后續(xù)的關(guān)鍵峰對也應(yīng)如此處理〕。8-4-2-2溶劑類型改變有機(jī)溶劑為等度別離中改變選擇性的一種常用手段，尤其對于中性樣品〔見第6章〕；在梯度洗脫中改換有機(jī)溶劑也可獲得類似效果。圖8-14所示為苯酚混合物的別離。圖8-14a中采用0→100%乙腈-水梯度，只有峰8╱9發(fā)生重疊。改善峰8╱9的別離度需要改變選擇性，以甲醇代替乙腈重復(fù)該別離〔見圖8-14b〕。因圖8-14a別離中18min以前無峰，第二次梯度〔圖8-14b〕以20%甲醇-水開始〔而不是圖8-14a中的0%乙腈〕。現(xiàn)在譜峰8╱9的別離得到改善，但譜峰對〔2╱3〕又成為關(guān)鍵峰對。圖8-14溶劑類型對梯度洗脫別離的影響樣品:苯酚混合物。條件：30×0.42cmC18柱；梯度如圖示：1.0ml╱min；室溫。以甲醇和乙腈作溶劑的等度別離，其色譜圖可能類似于圖8-14a和b〔即關(guān)鍵峰對發(fā)生變化〕。采用等度別離時，可用甲醇與乙腈的混合物〔50：50〕作流動相，以獲得比圖8-14a和b〔稍微〕好些的別離效果。在圖8-14的梯度別離中，可用相似的方法〔即B溶劑采用甲醇與乙腈的混合物〕。然而更好的方法說明前面峰對〔2╱3〕適合于乙腈洗脫，而后出峰對〔8╱9〕適合甲醇洗脫。該試驗說明運(yùn)行期間應(yīng)采用增大甲醇╱乙腈比例的梯度。見圖8-14c，樣品的整體別離效果明顯優(yōu)于前面的2次實驗。這時，峰對2╱3的別離效果與采用乙腈-水梯度時一樣好〔圖8-14a〕，而峰對8╱9的別離效果與采用甲醇-水梯度時一樣好〔圖8-14b〕，對于某些樣品，這種使色譜圖不同局部的選擇性發(fā)生不同變化的梯度洗脫方法非常有用。8-4-2-3其它條件許多研究報告顯示梯度洗脫選擇性的改變與其它條件有關(guān)〔主要針對離子樣品〕：pH，離子對試劑濃度〔見圖11-11〕，溫度；亦見圖11-9。這些條件及其它條件的優(yōu)先次序見圖7-7中的等度別離推薦表。當(dāng)?shù)榷群吞荻认疵撝械倪x擇性效果類似時，溶劑強(qiáng)度選擇性〔k*〕于梯度洗脫中比等度別離中重要得多。在梯度洗脫中使用緩沖液和離子對試劑時，需比等度洗脫更加小心。某些緩沖液在高%B流動相中的溶解度較小；而且當(dāng)%B改變時離子對試劑的吸附會發(fā)生變化〔見圖7-13，8-5-2-2節(jié)〕。8-4-3調(diào)整色譜柱條件當(dāng)針對參數(shù)k*和α優(yōu)化了保存值以后〔包括可能采用分段梯度〕，再改變柱長、固定柱顆粒大小和流速等柱條件，還可進(jìn)一步改善別離。由于等度別離中，改變柱條件對k無影響，所以可以改變柱條件〔如柱長〕，而無須擔(dān)憂k*，α的改變。但梯度別離卻非如此，由于k*依賴于柱尺寸和流速〔見式8-2〕。因而，如僅改變柱長或流速，別離效果將在2個不同方面產(chǎn)生影響：〔a〕柱塔板數(shù)N將會按所預(yù)測發(fā)生改變〔見2-3-3-2節(jié)〕，但〔b〕k*〔或α〕也會改變。流速改變的影響見圖8-15所示。圖8-15改變流速對梯度洗脫選擇性的影響樣品：肌紅蛋白的胰蛋白酶水解物。條件：8×0.62C8柱；60min梯度，10→70%乙腈-水梯度[〔a〕與〔b〕中均含0.1%三氟醋酸]；流速如圖示；350C。〔a〕全部譜圖；〔b〕〔a〕中2色譜圖的局部放大圖〔如箭頭所示〕。圖8-15a的2色譜圖中1組峰〔6個，箭頭所示〕分別在圖8-15b中放大示出〔即整個色譜圖的一局部〕。流速由0.5ml╱min變?yōu)?.5ml╱min時〔梯度時間不變〕使峰間距產(chǎn)生很大改變：峰5和5a完全重合，峰6和6a開始別離，峰6a和7的位置發(fā)生顛倒。通過改變梯度時間〔如圖8-13〕，選擇性可得益于圖8-15中的這些改變，而且這通常是最正確方案。然而，如在改變柱條件之前優(yōu)化k*和α，那么在改變柱條件時必須保持k*值恒定。否那么，N所獲得的改善可能由于α的損失而遜色。k*的恒定需保持Gs=〔Vm╱F〕〔Δ%B╱tG〕不變。即在改變流速〔F〕和╱或柱長〔Vm〕的同時調(diào)整梯度時間tG，這樣做并不難。如柱長增加x倍，梯度時間應(yīng)同樣增長x倍。如流速減小x倍，那么梯度時間也應(yīng)同樣增大x倍。改變流速或柱長對梯度洗脫運(yùn)行時間的影響〔保持k*不變〕與等度別離時相同〔即柱較長或流速較慢時，運(yùn)行時間會較長〕。圖8-16和表8-4所示為以圖8-8中除莠劑樣品為例，保持k*和選擇性不變時的柱條件優(yōu)化。梯度條件優(yōu)化后〔圖8-16a；25min梯度；40→77%B，2.0ml╱min〕別離度仍然較差：Rs=1.1〔關(guān)鍵峰對標(biāo)有星號〕。期望流速由2.0ml╱min降至1.0ml╱min時可改善別離度。然而為保持k*恒定，梯度時間必須同時由25min增至50min。圖8-16b〔Rs=1.3〕中，加倍的運(yùn)行時間，產(chǎn)生別離度的增加非常小。通常采用細(xì)粒徑柱〔<10μm〕改變流速時，情況往往如此。增加柱長通常更有效。圖8-16c示出了50cm柱，流速同圖8-16a時的別離效果。梯度時間必須再增至50min以保持k*不變，但現(xiàn)在別離度可勉強(qiáng)接受〔Rs=1.5〕。圖8-16除莠劑樣品的梯度別離與柱條件的關(guān)系條件如圖8-8，但梯度為40→77%B〔0.7%╱min〕與圖中所示，另見表8-4。表8-4k*保持不變時，除莠劑樣品的梯度別離與柱條件的關(guān)系a色譜柱條件別離柱長〔cm〕粒徑〔μm〕流速〔ml╱min〕Rs時間b〔min〕柱壓〔psi〕25102.01.125104025101.01.35052050102.01.55020802551.02.0502080A圖8-16的別離，柱條件如表；其它條件圖8-8，除了梯度為40→77%BB指梯度時間tG。如此時，可以考慮減小固定相粒度，如10μm→5μm。圖8-16d為這種別離結(jié)果，同時降低了流速以維持可接受的柱壓。梯度時間50min時別離度非常好〔Rs=2.0〕。注意如僅改變微粒大小那么不需要改變梯度時間以以保持k*恒定。由于5μm微粒柱需要適宜的壓力，所以需降低流速，反而需延長梯度時間。梯度洗脫中，選擇改變哪種柱條件，可參考對等度別離的討論〔見2-3-3節(jié)〕。無論是梯度還是等度情況下，提高N值均以延長運(yùn)行時間為代價。為使別離效果有所改善〔10~20%〕，增加運(yùn)行時間并不重要，而降低流速那么非常方便。當(dāng)需要較大增加Rs時，一般首選是增加柱長。假設(shè)必須增加別離度，而不增加運(yùn)行時間和柱壓，唯一選擇就是減小固定相粒度〔同時降低柱長和╱或流速〕。當(dāng)更換柱子〔柱長或微粒大小〕時，應(yīng)考慮到柱填料批次之間的微小差異會導(dǎo)致選擇性發(fā)生不利的變化〔見5-2-4節(jié)〕。選擇性優(yōu)化后，如別離度大于所需要，可增加流速和╱或減少柱長，降低過量的別離，換取較短的運(yùn)行時間。8-5實驗問題梯度洗脫同樣會遇到等度洗脫中對檢測、重現(xiàn)性和精密度等不利的實驗問題。梯度洗脫時流動相組成在運(yùn)行中不斷發(fā)生改變，因此會引起更多的影響和潛在的問題，其中一些已在本章開始處列出。本節(jié)中將對這些影響作進(jìn)一步討論。8-5-1設(shè)備對別離的影響：系統(tǒng)的滯留體積8-5-1-1設(shè)備差異用于梯度洗脫的儀器有2種：高壓混合系統(tǒng)和低壓混合系統(tǒng)，如圖8-17a中所示。高壓混合系統(tǒng)在泵后〔高壓狀態(tài)下〕立刻混合A溶劑與B溶劑，而低壓混合系統(tǒng)在泵前混合溶劑。在高壓混合〔HPM〕系統(tǒng)中，溶劑一經(jīng)混合，直接輸送至自動進(jìn)樣器或進(jìn)樣閥。對于低壓混合〔LPM〕儀器，溶劑先通過泵和有關(guān)組件，然后才到達(dá)進(jìn)樣器。圖8-17不同的梯度設(shè)備設(shè)計及其滯留體積VDM，混合器；S，進(jìn)樣器；C，色譜柱；箭頭表示其它組件，如泵、在線濾器等。梯度設(shè)備的設(shè)計對別離的主要影響在于“滯留〞體積VD，如圖8-17b所示。其它條件相同時，LPM系統(tǒng)的VD值較大。表8-5中總結(jié)一些代表性的HPLC設(shè)備的滯留體積值。自動進(jìn)樣器通常會大大增加VD。包括自動進(jìn)樣器在內(nèi)，VD值范圍一般為2~8ml，但管路安裝不好的設(shè)備滯留體積值會超過10ml。注意，進(jìn)樣環(huán)體積也增加滯留體積，所以如進(jìn)樣環(huán)改變，HPLC系統(tǒng)的VD值也會改變。表8-5一些代表性的HPLC梯度系統(tǒng)的滯留體積VD值系統(tǒng)VD〔ml〕無自動進(jìn)樣器帶自動進(jìn)樣器Beckmansystemgold2.3Bischoffa1.0Dupont88005.5Hewlett-Packard10900.52.3IBMLC-95334.5Perkin-ElmerAnalystb3.43.9Perkin-ElmerAnalystc6.16.6Shimadzud3.1Spectra-Physics87004.5VarianStare1.0WatersModel5015.08.0fA2250型泵，附Alcott2250型自動進(jìn)樣器。B620型泵，附ISS100C型自動進(jìn)樣器；除去混合管線。C同B附混合管線。DLC10AD泵，ICIAS2000型自動進(jìn)樣器；EWISP712型泵；8-5-1-2不同HPLC系統(tǒng)別離效果的差異不同設(shè)備滯留體積對梯度別離時的主要影響是使樣品保存時間發(fā)生變化〔變化量與滯留時間tD=Vd╱F有關(guān)〕。增加的滯留體積相當(dāng)于在梯度開始時增加的等度延遲。這一影響見圖8-18a所示的假想別離。如滯留體積為0.5ml，流速2.0ml╱min，滯留時間tD=0.5min，末峰在22min時離開柱子。采用Vd=10ml，tD=10min的系統(tǒng)進(jìn)行同樣別離，末峰在31.5min時離開柱子[即保存值增加量〔9.5min〕與tD值改變相等]。10ml系統(tǒng)的初始峰保存值會更長，但保存時間差異〔與0.5ml系統(tǒng)相比〕不那么大〔≈3min〕。另外，采用10ml系統(tǒng)別離時，初始峰的別離度更好一些。圖8-18a所示為采用Vd值不同的HPLC系統(tǒng)進(jìn)行梯度別離時，出現(xiàn)的典型情況。圖8-18不同的滯留時間對梯度別離的影響1.0ml╱min，〔a〕典型樣品；〔b、c〕非典型樣品。對某些樣品來說，圖8-18a的結(jié)果伴有色譜圖前部的峰間距和別離度改變。圖8-18b和c所示說明了不同樣品的這種效果。在圖8-18c中，采用Vd=5ml的系統(tǒng)別離譜峰1~4均到達(dá)基線別離。但是，采用滯留體積不同的設(shè)備〔0.5或10ml〕會導(dǎo)致峰間距的較大變化和樣品別離度的降低〔見圖8-18c〕。有可能對這種影響加以預(yù)測〔見圖8-18b和c〕；初始譜峰的峰間距〔選擇性〕隨梯度變化速率或初始%B值而改變的樣品可能會發(fā)生圖8-18b中問題。采用計算機(jī)模擬〔見10-2-2節(jié)〕，可以預(yù)測系統(tǒng)滯留體積對別離效果的影響，而不需用滯留體積不同的系統(tǒng)進(jìn)行另外的實驗。改變系統(tǒng)滯留體積對梯度別離的進(jìn)一步影響，見圖8-19中對一系列樣品的重復(fù)分析。圖8-19a為一個Vd=0.5ml的系統(tǒng)，樣品注入后梯度很快到達(dá)自動進(jìn)樣器〔箭頭所示〕。每一次梯度運(yùn)行結(jié)束時，用起始流動相沖洗柱使重新平衡。圖8-19b為在Vd=10ml系統(tǒng)上進(jìn)行的同樣別離。由于梯度延遲到達(dá)自動進(jìn)樣器，在前一梯度完成前即第二次注入的樣品。因此，這些樣品在初始的高%B條件下被洗脫，先流出譜峰〔A~D〕未到達(dá)別離。圖8-18c連續(xù)進(jìn)樣中不同滯留時間對梯度別離的不利影響20min梯度，35→65%B，1ml╱min；每次運(yùn)行開始前需用A-溶劑平衡柱5min；〔a〕滯留體積Vd=0.5ml的HPLC系統(tǒng)的別離與梯度曲線；〔b〕滯留體積Vd=10ml的HPLC系統(tǒng)的梯度別離與梯度曲線；由于不同HPLC系統(tǒng)的滯留體積不同，圖8-19b中流動相問題可通過延長柱平衡時間加以防止。所需的延長時間等于增加的滯留時間。如圖8-19所示，增加的滯留體積為9.5ml，流速1ml╱min。因此，柱平衡時間應(yīng)增加的tD差值，等于滯留體積之差除以流速：9.5╱1=9.5min。關(guān)于滯留體積影響的進(jìn)一步討論，見8-5-1-3節(jié)。從前文討論可明顯看出，最終梯度方法必須考慮到將用于分析的HPLC系統(tǒng)之間可能存在的滯留體積的差異。否那么，在一套HPLC系統(tǒng)上建立好的方法，在不同的HPLC系統(tǒng)上應(yīng)用時可能不令人滿意。當(dāng)柱內(nèi)徑減小時，系統(tǒng)滯留體積的影響會更甚，因為這類柱所需的低流量會使梯度到達(dá)柱入口的時間延遲更長〔tD=Vd╱F〕。因此，采用細(xì)內(nèi)徑柱〔如1mm或更小〕的別離通常需要Vd值非常小的特殊梯度洗脫設(shè)備。8-5-1-3減小設(shè)備滯留體積的影響因為滯留體積的差異是梯度方法在不同系統(tǒng)之間不能很好移植的主要原因，在方法建立步驟中有必要說明原系統(tǒng)的滯留體積。另外，建立能適應(yīng)不同滯留體積的梯度方法非常有用。所報道的減小不同滯留體積對別離效果影響的方法有3種。第一〔最好的〕，某些系統(tǒng)控制器可以在梯度開始后的精確時間進(jìn)樣。如延遲進(jìn)樣時間tD，梯度和樣品可同時到達(dá)柱進(jìn)口。該步驟消除了滯留體積對別離的影響。第一次運(yùn)行〔從梯度開始〕可能較長〔因為Vd和tD值較大〕，但以后的運(yùn)行時間是相同的，與Vd關(guān)系不大。如果從進(jìn)樣時開始計算保存時間，不同梯度系統(tǒng)應(yīng)是相同的。第二，如梯度過程開始可插入一段等度過程，用Vd值較大的系統(tǒng)時那么可以縮短這一過程；而用Vd值較小的系統(tǒng)時那么可延長這一過程。以此方式，樣品和梯度那么會同時到達(dá)柱進(jìn)口。為明確說明，假設(shè)用Vd=5ml的系統(tǒng)建立一種樣品的方法。如該方法的初始等度過程為5ml，那么梯度會延遲5＋5=10ml。通過縮短或延長該等度過程可在其它〔Vd值不同的〕系統(tǒng)中獲得同樣的梯度延遲。例如，如別離在Vd=2ml的第二個系統(tǒng)上進(jìn)行，為到達(dá)同樣別離效果，等度過程必須增至8ml〔8＋2=10ml梯度延遲〕。同樣，對于Vd=10ml系統(tǒng)的別離，等度過程進(jìn)行應(yīng)降至0ml〔0＋10=10ml〕。通過此方法，每個樣品的運(yùn)行時間在各〔Vd不同的〕HPLC系統(tǒng)中是相同的。各系統(tǒng)的樣品保存時間也相同。然而，各樣品的運(yùn)行時間比前面的〔經(jīng)時間tD后進(jìn)樣〕要長。第三，如初始流動相組成〔>20%B，最好以一較陡梯度從5%B至初始%B開始。例如，初始流動相為30%B，在此梯度之前先進(jìn)行1~2min的5→30%B的分段梯度。這樣使樣品存留在柱進(jìn)口處，直到原梯度〔30%B〕開始到達(dá)柱進(jìn)口。因而可防止圖8-18中滯留體積的影響；但是組分保存時間將改變，改變量等于2系統(tǒng)間滯留時間之差。對于Vd較高的系統(tǒng)，第一樣品的運(yùn)行時間會增加，但后面樣品的運(yùn)行時間相同，與Vd大小關(guān)系不大。各組分的運(yùn)行時間長于經(jīng)時間tD后注入的樣品〔第一種選擇〕。8-5-1-4滯留體積的測定在建立梯度方法前必須知曉所用設(shè)備的Vd值。HPLC梯度系統(tǒng)的滯留體積可如下進(jìn)行測定：將色譜柱與系統(tǒng)斷開，用一零體積連接件連接柱進(jìn)口與出口。用甲醇作為A與B溶劑，在B溶劑中參加0.1%丙酮，調(diào)節(jié)檢測器波長〔≈260nm〕，以使B溶劑的吸收度達(dá)滿刻度〔0.1AU〕，以1.0ml╱min運(yùn)行線性梯度：20min梯度，0→100%B。該梯度圖形見圖8-20a〔實線〕所示。測定吸收度到達(dá)峰開始與接束之間一半的時間，減去10min〔梯度時間的一半〕，結(jié)果為；tD=Vd╱F；在開始梯度方法建立之前，確定梯度設(shè)備運(yùn)行正常也非常重要。圖8-20a測試的梯度圖形可使操作者估價該HPLC系統(tǒng)的性能，如圖8-20b~d所示。由于梯度通過設(shè)備時發(fā)生擴(kuò)散，梯度的開始和結(jié)束會有些變圓滑〔見圖8-20b箭頭所指〕。實際梯度〔實線〕偏移于0與100%B〔見箭頭〕的理論值〔虛線〕不應(yīng)超過3%。梯度也會呈現(xiàn)一不規(guī)那么的非線性軌跡〔見圖8-20c〕。實際和理論梯度之間的偏離不應(yīng)超過1~2%；這也可通過運(yùn)行一系列步長10%B的分段梯度來檢測。最后，實際梯度可能是非線性的〔見圖8-20d〕，這種情況下可參考設(shè)備手冊，調(diào)整該HPLC系統(tǒng)〔梯度控制局部〕，以消除梯度的非線性。8-5-2可重現(xiàn)的別離8-5-2-1柱再生在前一節(jié)中，我們討論了由梯度設(shè)備差異引起的方法重現(xiàn)性問題。梯度洗脫中別離重現(xiàn)性不好還會由其它原因引起。方法建立通常采用純標(biāo)準(zhǔn)品，而實際樣品可能會含晚流出的干擾。假設(shè)選取梯度的最終%B為與洗脫有關(guān)譜峰〔如圖8-16b〕，而實際樣品中含有的晚流出物那么會在柱上發(fā)生聚集，因而會改變柱效和保存值〔如圖8-4b所示〕。在別離含有這類晚流出物的樣品時，別離結(jié)果會逐漸發(fā)生變化。由于需要梯度洗脫的樣品通常含有晚流出物，故通常在梯度洗脫末尾時保持100%B或快速將梯度改變至100%B一段時間〔如2~5倍柱體積〕，以便采用強(qiáng)溶劑來清洗柱子。8-5-2-2柱平衡梯度洗脫中的柱平衡指上一次梯度運(yùn)行結(jié)束后與下次進(jìn)樣之前，以A溶劑〔初始流動相〕沖洗色譜柱；見圖8-19a。梯度洗脫中，最好在進(jìn)樣和下一次梯度開始之前，用初始流動相徹底平衡色譜柱。如不能徹底平衡柱子，色譜圖中的早期譜峰的保存值和別離效果會發(fā)生改變。柱平衡一般需要5~10倍柱體積的初始流動相〔例如15×0.46cm的色譜柱為7~15ml〕。然而，這一平衡體積隨流動相和樣品而異，所以徹底平衡色譜柱需根據(jù)具體操作來確定。完全平衡可由以下方法檢驗：〔1〕用大于30倍柱體積的初始流動相沖洗色譜柱；〔2〕進(jìn)行梯度別離；〔3〕用規(guī)定體積〔5~10倍柱體積〕的初始流動相沖洗柱子；〔4〕立刻重復(fù)該別離。如早出峰的保存時間在2次運(yùn)行之間不變，那么采用的平衡溶劑體積是足夠的〔可能超過所需〕。對于某一梯度方法規(guī)定的平衡溶劑體積，應(yīng)考慮到系統(tǒng)滯留體積之間可能的差異；見圖8-19和相關(guān)討論。如在流動相中參加離子對試劑或胺改性劑，那么在A和B溶劑中都應(yīng)參加。8-20HPLC系統(tǒng)的梯度形狀〔a〕設(shè)備的滯留體積導(dǎo)致的梯度延遲；〔b〕系統(tǒng)內(nèi)的擴(kuò)散導(dǎo)致的梯度曲線變圓滑；〔c〕混合誤差導(dǎo)致的梯度不規(guī)那么；〔d〕非線性梯度。為到達(dá)柱平衡，還可以使梯度反向運(yùn)行。即〔樣品洗脫結(jié)束后〕梯度再從終止到起始%B運(yùn)行〔如開始梯度為10→80%B，這時可運(yùn)行80→10%B梯度以平衡色譜柱〕。最好在運(yùn)行結(jié)束時，立即將%B由終止值變至起始值〔80→10%B，然后用10%B沖洗色譜柱〕這樣更簡單且同樣有效。為使每次梯度運(yùn)行間色譜柱能快速平衡，應(yīng)防止以0%B〔不加有機(jī)物的水或緩沖液〕作為初始流動相。假設(shè)可能，初始的流動相組成應(yīng)大于3%B。范圍有限〔如30~50%B〕的梯度由于開始和終止流動相組成的差值較小。通常需要的平衡體積較小，有研究主張在A溶劑中加3%丙醇，可以加快柱平衡。然而并未說明用5%B的初始梯度開始的簡單手段需要的柱平衡時間更長。當(dāng)采用梯度方法分析一系列樣品時，最好每份樣品都保持恒定的平衡時間。用作流動相的水通常會被聚集在柱頭的組分污染，并在梯度期間洗脫出。產(chǎn)生的人工峰大小與平衡時間的長度〔或平衡柱所用水的量〕成正比。詳情見8-5-3-2節(jié)。8-5-2-3不準(zhǔn)確的梯度別離重現(xiàn)性較差也會由梯度的不準(zhǔn)確引起。梯度不準(zhǔn)確更易導(dǎo)致不同梯度系統(tǒng)之間的別離產(chǎn)生差異，但是同一梯度設(shè)備不同運(yùn)行之間保存值也可能不同。這對于非常平坦的梯度和高分子量樣品，可能性更大。在這類情況下，梯度設(shè)備混合的A與B溶劑與梯度控制器中編程設(shè)定的值相比，流動相組成會發(fā)生隨機(jī)的變化〔如0.1~0.3%〕。一般情況下，這些小的〔隨機(jī)的〕誤差對樣品保存時間的影響很小。但是，對于大分子量樣品，即使如此微小的%B變化也會導(dǎo)致梯度洗脫中保存時間的很大改變。在極端情況下，會導(dǎo)致一單峰分裂出1個或多個人工峰。當(dāng)疑心保存時間發(fā)生變化是由梯度混合不準(zhǔn)確所致的%B隨機(jī)波動而引起時，通過防止使用儲液器中的純?nèi)軇〢和B，可較低此問題的發(fā)生。這樣，假設(shè)梯度范圍為20%→50%B，那么在A容器中裝20%B，在B容器中裝50%B。相對于使用純?nèi)軇〢和B，可減少0.3倍的梯度混合誤差〔即時%B值〕。8-5-3基線問題梯度中的基線漂移和人工峰比等度洗脫中普遍得多。如圖8-3b所示，在別離過程中〔3~23min〕，梯度運(yùn)行基線呈現(xiàn)升高趨勢。其它情況時，空白梯度實驗〔未進(jìn)樣〕會在色譜圖中出現(xiàn)明顯的峰及漂移。在開始建立梯度洗脫方法之前，進(jìn)行一次空白運(yùn)行〔如5→100%B〕永遠(yuǎn)是明智的。8-5-3-1漂移梯度洗脫中，基線向上漂移〔如圖8-3b所示〕非常普遍，通常由所用A與B溶劑的紫外吸收差異所致。在反相梯度洗脫中，有機(jī)溶劑B濃度在別離期間是增加的，有機(jī)溶劑的紫外吸收總是大于水，因此，采用紫外檢測器時，這種梯度漂移尤為普遍。與吸收有關(guān)的基線漂移可通過運(yùn)行一次空白梯度加以證實；基線應(yīng)呈線性，向上漂移的時間等于梯度時間tG。檢測器波長越短，設(shè)置越靈敏，這種漂移越顯著。THF作溶劑時，由于THF在250nm以下吸收很強(qiáng)，漂移尤其顯著。與吸收度相關(guān)的漂移可通過“吸收匹配〞來消除〔即在A溶劑中參加UV吸收化合物，以增加A溶劑的吸收，使與B溶劑相等〕。任何UV吸收物質(zhì)都可以使用，但該添加劑在反相條件下必須是非保存的〔親水性很強(qiáng)〕，不與樣品反響或發(fā)生作用。這類化合物包括無機(jī)離子如硝酸鹽、亞硝酸鹽或疊氮化物，小有機(jī)離子〔如甲酸、