防腐劑的防腐效力檢測(cè)本研究結(jié)合美國(guó)藥典（USP）、歐洲藥典（EP）及中國(guó)藥典（2010，防腐效力檢測(cè)的指導(dǎo)原則）等對(duì)某防腐劑的防腐效力進(jìn)行檢測(cè)，從實(shí)驗(yàn)用菌種、實(shí)驗(yàn)方法等方面考察，建立某防腐劑的防腐效力的檢測(cè)方法并評(píng)價(jià)相應(yīng)防腐劑的防腐效力。防腐劑一般是化學(xué)物質(zhì)，經(jīng)常會(huì)受環(huán)境因素的影響降解或失活。為確保防腐劑效力的有效性，有必要對(duì)含防腐劑最終產(chǎn)品的防腐效力進(jìn)行科學(xué)有效的評(píng)價(jià)。防腐效力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)程序一、USP、EP防腐劑防腐效力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法介紹USP、EP對(duì)防腐效力檢測(cè)均有具體規(guī)定，雖然內(nèi)容特別是判定標(biāo)準(zhǔn)有所不同，但所用的實(shí)驗(yàn)方法和原理是一致的：取一定量挑戰(zhàn)性微生物（challengemicroorganisms），接種至一定量的被測(cè)樣品中，在規(guī)定溫度下培養(yǎng)接種試樣。在28d的培養(yǎng)期內(nèi)，于規(guī)定時(shí)間點(diǎn)取樣，通過平皿菌落計(jì)數(shù)法（plate-countmethod）或其它方法測(cè)定接種樣品中剩余的存活菌濃度，通過對(duì)比菌濃度下降值，判定樣品是否符合規(guī)定。二、檢測(cè)用的微生物USP、EP及中國(guó)藥典推薦用的挑戰(zhàn)微生物挑戰(zhàn)性微生物USPEP中國(guó)藥典白色念珠菌CandidaalbicanATCC10231ATCC10231,NCPF3179,IP48.72CMCC(F)98001黑曲霉AspergillusnigerATCC16404ATCC16404,IMI149007,IP1431.83CMCC(F)98003大腸埃希菌EscherichiacoliATCC8739ATCC8739,NCIMB8545,CIP53.126CMCC(B)44102銅綠假單胞桿菌PseudomonasaeruginosaATCC9027ATCC9027,NCIMB8626,CIP82.118CMCC(B)10104金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC6538ATCC6538,NCIMB9518,NCTC10788CIP4.83CMCC(B)26003試驗(yàn)所用菌株傳代次數(shù)不得超過5代。我們選用的菌株為中國(guó)藥典的規(guī)定菌種，前期工作為使用本實(shí)驗(yàn)室保存和收集菌種。三、培養(yǎng)基適用性檢查按照藥典規(guī)定進(jìn)行。四、抑菌效力檢測(cè)1.菌液的制備接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基或胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)30~35℃接種白色念珠菌于沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)25℃采用比濁法制成每毫升含菌數(shù)為108cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，經(jīng)23~28℃培養(yǎng)5~7天,加入3~5ml含0.05%（ml/ml）的聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，并用比濁法制成每毫升含孢子數(shù)為108cfu的孢子懸液2.菌液濃度的測(cè)定方法（采用平皿法測(cè)定1ml菌懸液的菌數(shù)）分別取上述菌液適量，用無菌0.9%氯化鈉溶液按10倍系列稀釋到適宜的稀釋度,取稀釋液1ml加入平皿中，平行制備兩個(gè)平皿,立即傾注45℃約15ml相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基,待凝固后細(xì)菌置30～35℃培養(yǎng)24～48h，真菌置23～28℃培養(yǎng)48～72h，3.供試品接種取20ml供試品5份,分別加入上述已備妥的菌懸液或孢子懸液各適量(接種菌液的體積不超過供試液體積的1%,使最終挑戰(zhàn)菌濃度為105~106cfu/ml)作為供試液，同時(shí)設(shè)不含防腐劑的菌懸液陰性對(duì)照。樣品接種后在20～25℃避光密閉保存，在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)（分別經(jīng)0、6、24、48h及7、14、28d等規(guī)定時(shí)間）取樣，用平皿菌落計(jì)數(shù)法（按菌液濃度的測(cè)定方法）測(cè)定樣品中剩余菌濃度，根據(jù)菌數(shù)測(cè)定結(jié)果，計(jì)算1ml（或1mg）供試品各試驗(yàn)菌所加的菌數(shù)及各間隔時(shí)間的菌數(shù)，并換算成lg值。最終判定所測(cè)結(jié)果是否符合規(guī)定。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸出見表1和表2表1接種不同時(shí)間段各菌存活濃度試驗(yàn)菌樣品編號(hào)活菌計(jì)數(shù)（cfu/ml）0h6h24h48h7d14d28d大腸埃希菌銅綠假單胞桿菌金黃色葡萄球菌白色念珠菌黑曲霉注;每組均為三次獨(dú)立結(jié)果Table2TheresultsoftheantisepticeffectinX菌種各時(shí)間cfu/ml濃度對(duì)數(shù)下降值大腸埃希菌Oh7d14d28d7d14d28d銅綠假單胞桿菌金黃色葡萄球菌白色念珠菌黑曲霉4.防腐劑的中和方法研究（此項(xiàng)內(nèi)容，不知您是否需要做？）在檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，需先消除（中和）產(chǎn)品中防腐系統(tǒng)剩余的防腐效力，再用平皿菌落計(jì)數(shù)法計(jì)菌數(shù)，才能準(zhǔn)確測(cè)定防腐劑的防腐效力，否則剩余防腐劑的效力將影響測(cè)定結(jié)果，以致高估防腐效力。中和方法的驗(yàn)證（validation）USP明確規(guī)定，對(duì)比以下3個(gè)處理組的生長(zhǎng)結(jié)果驗(yàn)證中和方法。第1組測(cè)試組，該組產(chǎn)品按規(guī)定中和方法處理，然后加入低濃度挑戰(zhàn)性微生物（100cfu/mL以內(nèi)），培養(yǎng)其生長(zhǎng)；第2組是蛋白胨對(duì)照組，用蛋白胨代替樣品，同法進(jìn)行中和處理，作為測(cè)試液，接種及恢復(fù)生長(zhǎng)的操作同第1組；第3組是