胚胎植入前遺傳學診斷小鼠高溫應激反應調節能力的評估

種植前的遺傳診斷是基于體外受精、胚胎移植（ivf-et）以及現代生物學、細胞生物學和遺傳因素的診斷方法。它規定了在移植胚胎之前，分析遺傳物質，并選擇無遺傳缺陷的胚胎進行移植，以確保健康子代的出生。然而,PGD過程涉及體外受精、胚胎體外培養、胚胎移植、卵裂球活檢等一系列非自然或侵入性的干預操作,這些操作作用于胚胎早期發育的敏感時期,其對子代的生長發育可能產生不良影響,這在PGD廣泛應用于臨床前并沒有經過全面評估。近年來已有研究顯示胚胎培養及移植操作可使其子代生理指標發生改變或功能異常,本課題組前期研究證實經卵裂球活檢出生的小鼠腦發育異常,罹患神經退行性疾病的風險增加。因此,對PGD子代的生長發育狀況進行全面評估非常重要。個體的正常生長發育依賴體內外環境的協調,使機體各系統、器官達到正常、穩定狀態。當受到體內及外界環境變化的刺激時,機體會做出相應的適應性反應來維持和重建內環境穩態,即應激反應。應激反應主要以神經內分泌改變為主,包括藍斑(LC)-交感-腎上腺髓質系統和下丘腦-垂體-腎上腺皮質系統(HPA軸)的興奮所引起的一系列神經內分泌反應以及由此引起的全身非特異性反應。若機體做出適應性調節,則能順應正常的生長發育,表現出正常的生理功能;若適應、調節能力異常,則生長發育及功能異常。因此,應激能力與個體的生理及病理改變相關。PGD出生的個體,因為在受精和胚胎發育早期階段受到一系列非生理性操作,其出生后對于環境變化等刺激因素的反應性是否會受到影響?其應激能力是否會發生改變,導致其適應環境的調節能力發生異常,進而引起生長發育和生理功能的異常?這些問題都有待解決,對于全面評估PGD子代健康非常重要。本研究擬構建PGD出生的小鼠模型,以正常受孕出生的小鼠(Normal)為對照,對出生后5周齡小鼠的應激能力進行評估。本研究以45℃高溫作為環境變化因素,檢測熱應激下兩組小鼠藍斑(LC)-交感-腎上腺髓質系統及HPA軸的結構和功能狀態。1材料和方法1.1抗bam、抗br清潔級ICR小鼠[南京醫科大學實驗動物中心,動物合格證號:SCXK(蘇)2002-0031]。放免試劑盒(北京華英生物技術研究所),c-Fos抗體(Abcam公司,美國),二抗(北京中杉金橋),RNeasyPlusMicroKit(Qiagen公司,德國),PrimeScriptRT-PCRKit、SYBRPremixExTaqⅡKits(TaKaRa公司,日本)。1.2方法1.2.1自然交配妊娠小鼠實驗分為實驗組(PGD)和對照組(Normal)。PGD組取小鼠自然交配后的受精卵,在體外發育至四細胞期,隨機移除1個卵裂球后移植入假孕鼠而出生的小鼠,Normal組為自然交配分娩的小鼠。1.2.2試驗小鼠致死亡時間測定選擇5周齡小鼠,每組各36只。每只小鼠單獨放在28cm×17cm×12cm籠子里,置于45℃溫箱中,保證氧氣供給,觀察每只小鼠的致死亡時間。為進一步評估熱狀態下小鼠應激系統的調節能力,取另一批小鼠進行高溫應激實驗,在45℃下30min的時間點,摘眼球取血,離心后取小鼠血清以及應激器官下丘腦、藍斑和腎上腺組織,留待檢測。1.2.3血清激素檢測血清的腎上腺素、去甲腎上腺、促腎上腺皮質激素(ACTH)和皮質酮運用放免試劑盒測定。1.2.4組織石蠟切片制備(1)脫水:10%福爾馬林固定后腎上腺、腦組織進行各級濃度乙醇梯度脫水,70%乙醇Ⅰ—70%乙醇Ⅱ—80%乙醇Ⅰ—80%乙醇Ⅱ—90%乙醇Ⅰ—90%乙醇Ⅱ—100%乙醇Ⅰ—100%乙醇Ⅱ。每一步驟脫水為30min;(2)透明:組織脫水后,進行二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ透明處理,分別為15min;(3)浸蠟:透明后組織浸入56℃熔點石蠟中,分別浸石蠟Ⅰ和石蠟Ⅱ各45min;(4)包埋:包埋機打開預熱,融化石蠟,用包埋筐包埋組織,然后置于4℃恒溫冰臺上冷卻、凝固石蠟;(5)切片:石蠟切片機將包埋好的組織石蠟塊切成薄片,每張厚度為5μm;(6)貼片:水槽盛適量水,加熱至42℃,將切片置于水槽中展片,然后用處理過的玻片將蠟片貼于玻片上,鉛筆做好標記;(7)烘片:將制作好的石蠟切片置于65℃恒溫箱中過夜,使切片干燥;(8)脫蠟水化:切片首先通過二甲苯Ⅰ15min和二甲苯Ⅱ15min進行脫蠟,然后經過100%乙醇Ⅰ—100%乙醇Ⅱ—90%乙醇—80%乙醇—70%乙醇水化,每個步驟5min;(9)蘇木素染色:三蒸水洗片2次,每次5min,蘇木素染色5min,流水沖10min;(10)鹽酸分色:1%鹽酸中放置1~2s,流水沖10min;(11)伊紅染色:水溶性伊紅染色2~3min;(12)脫水透明:依次經過70%乙醇—80%乙醇—90%乙醇—100%乙醇Ⅰ—100%乙醇Ⅱ,每個步驟5min,再經過二甲苯Ⅰ10min和二甲苯Ⅱ10min;(13)封片:在組織上滴中性樹膠進行封片,標記標本,烘干后常溫保存;(14)光鏡下觀察:AxionVision2plus(ZEISS)顯微鏡觀察,AxionVision3.0拍照。1.2.5家兔抗c-fos抗體的觀察取腦組織,石蠟包埋、5μm切片,根據腦圖譜定位PVN。經過脫蠟水化、去內源性過氧化物酶、抗原修復、封閉,兔抗c-Fos抗體(1∶100)4℃孵育過夜,二抗37℃孵育1h,然后DAB顯色、封片,最后在AxioVision3.0下觀察拍照,ImageJ1.43u軟件計數分析。1.2.6免疫組化檢測c-fos-goat的表達全腦組織取下后,4%PFA固定過夜,20%蔗糖緩沖液中24h,30%蔗糖緩沖液中24h,然后取藍斑所在腦組織,OCT包埋、切片5μm。PBS洗片后封閉1h,c-Fos抗體(1∶100)4℃孵育過夜。PBS洗片后加二抗羊抗兔IgG/FITC(1∶500),37℃避光孵育1h。再洗片,室溫封閉1h,一抗TH(1∶1000)4℃孵育過夜。然后洗片,加二抗AlexaFluor647goatantichickenIgG(1∶1000),37℃孵育1h。孵育后,Hoechst染核,DABCO封片,ZEN2009軟件拍照,ImageJ1.43u軟件計數分析。1.2.7甘油封片冰凍切片5μm,4%PFA固定40min,PBS洗片,油紅O染色10min,PBS沖去多余染液,蘇木素染核30s,流水沖10min,1%鹽酸1~2s,流水沖10min,甘油封片。AxioVision3.0拍照,ImageJ1.43u軟件計數分析。1.2.8反轉錄試驗RNeasyPlusMicroKit提取腎上腺RNA,反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA,SYBRPremixExTaqⅡKits應用于RealtimePCR。所用的基因引物如下表1。1.3均數標準差t采用SPSS13.0統計軟件,分析數據以均數±標準差(ue0af±s)表示,兩組間比較進行t檢驗。P≤0.05認為差異有統計學意義。2結果2.1小鼠的死亡時間在45℃應激條件下,PGD小鼠平均耐受至死亡時間為59.31min,顯著低于Normal小鼠的平均死亡時間79.63min(P<0.001,圖1)。2.2代謝相關激素在應激原的刺激下,一方面藍斑神經元被激活,引起交感-腎上腺髓質反應,使腎上腺髓質的嗜鉻細胞分泌腎上腺素和去甲腎上腺素增加。另一方面,應激原還激活HPA軸,下丘腦室旁核神經元活性增加,刺激垂體前葉分泌促腎上腺皮質激素(ACTH),促進腎上腺皮質分泌糖皮質激素(在小鼠中主要為皮質酮)。因此應激相關激素的水平反映小鼠的應激能力。本研究檢測了兩組小鼠血腎上腺素、去甲腎上腺素、ACTH和皮質酮水平,結果顯示,在45℃30min的熱應激下,PGD和Normal兩組小鼠的血清腎上腺素、去甲腎上腺素、皮質酮和ACTH水平均無顯著差異(P>0.05,圖2)。2.34在5.30分鐘的高溫響應下，藍色信號和pvn的結構和功能狀態的評估2.3.1組織結構觀察根據小鼠腦圖譜,定位腦組織藍斑和PVN,制作石蠟切片并作HE染色,觀察其組織結構。結果顯示,PGD和Normal兩組小鼠在藍斑和PVN未見明顯的形態結構異常,兩組之間無明顯差異(圖3)。2.3.2熱應激對藍斑-去甲腎上腺素能神經系統的活性影響c-Fos是一種原癌基因,可在數分鐘內對外界刺激做出反應,并進行表達,被稱為早期改變基因。神經元興奮或狀態變化時,c-Fos表達迅速增加,因此,免疫組化法檢測出高水平的c-Fos蛋白被用作神經元活動變化的標志。酪氨酸羥化酶(TH)存在于兒茶酚胺能神經元的胞漿中,是兒茶酚胺生物合成過程中的限速酶,可作為藍斑-去甲腎上腺素能神經細胞的標記物。經PGD和Normal兩組小鼠藍斑c-Fos/TH免疫熒光雙染,計數藍斑TH陽性細胞數量,再計數TH陽性細胞中c-Fos陽性的細胞數量,計算c-Fos/TH陽性的細胞數比例,可反映藍斑-去甲腎上腺素能神經元的活性狀態。結果顯示,在45℃30min熱應激下,PGD和Normal兩組小鼠藍斑區域去甲腎上腺素能神經元的活性無明顯差異(P>0.05,圖4)。對PGD和Normal兩組小鼠下丘腦室旁核進行c-Fos免疫組化染色,計數陽性細胞,PGD和Normal兩組小鼠比較無顯著差異(P>0.05,圖5)。2.44謝及心血管系統腎上腺是體內調節多種生理過程的內分泌器官,在應激反應、代謝及心血管系統方面發揮著重要作用。腎上腺分泌激素受到機體應激反應的調節,腎上腺由皮質和髓質組成,皮質主要分泌糖皮質激素,髓質主要分泌兒茶酚胺(腎上腺素和去甲腎上腺素)。2.4.1小鼠臟器結構的變化腎上腺組織石蠟切片經HE染色觀察PGD和Normal兩組小鼠的腎上腺皮質和髓質,未見明顯的形態結構異常,兩組間無顯著差異(圖6)。2.4.2腎上腺皮質和骨髓物質合成分泌激素的功能評估2.4.2.糖激素合成的關鍵分子表達糖皮質激素的合成以膽固醇為原料,首先通過類固醇激素合成急性調節蛋白(StAR)的作用,將膽固醇轉運入線粒體內,再由一系列經典類固醇生成酶類:細胞色素P450側鏈裂解酶(P450SCC)、3β-羥基類固醇脫氫酶(3-βHSD)、細胞色素P45021-羥化酶(P450c21)、細胞色素P45011β-羥化酶(P450c11),催化合成糖皮質激素。將一側腎上腺組織進行冰凍切片并油紅O染色,反映腎上腺皮質中膽固醇的含量。計數油紅O染色的陽性信號,并在兩組小鼠之間進行比較,結果顯示:在45℃30min熱應激下,PGD和Normal兩組小鼠的腎上腺皮質油紅陽性信號無差異(P>0.05,圖7)。糖皮質激素合成途徑中任何一種酶的異常都能導致激素合成障礙和其前體物積聚,造成代謝紊亂。用Real-timePCR檢測腎上腺中重要調節蛋白及相關酶的mRNA水平,驗證PGD和Normal兩組小鼠參與激素合成的關鍵分子表達是否有差異。結果顯示:在45℃30min應激下,PGD小鼠的P450c11表達較Normal組偏高(P<0.05,圖8);StAR和其他類固醇生成酶的表達水平在兩組小鼠間無統計學差異。2.4.2.pnnt表達腎上腺素為兒茶酚胺合成通路中最終產物,由去甲腎上腺素在苯乙醇胺甲基轉移酶(PNMT)的催化下轉化生成。若PNMT異?？蓪е履I上腺素合成異常。用Real-timePCR檢驗腎上腺PNMT表達水平。結果顯示:在45℃30min應激下,PGD和Normal兩組小鼠的PNMT表達量無顯著差異(P>0.05,圖9)。3pgd小鼠對45高溫應激的反應調節能力PGD是對有遺傳風險的胚胎進行植入前遺傳物質分析的診斷方法,是輔助生殖的重要組成,在其應用過程中涉及諸多非生理性操作。由于PGD應用時間短,其子代的健康狀況缺乏大樣本、長時期、多中心的流調資料。目前,對PGD操作及其出生子代進行系統、長期的安全評估仍是非常重要和迫切的課題。本研究運用小鼠模型,選取對個體生長發育具有重要意義的應激能力作為評估著眼點,在45℃熱應激下評估PGD小鼠對于環境變化的反應調節能力,以期為全面評估PGD子代健康提供有價值的信息。通過觀察PGD小鼠和對照小鼠在45℃高溫環境下的耐受時間,發現PGD小鼠在熱應激下的存活時間明顯低于Normal小鼠,提示其對高溫環境的反應和調節能力異常。因此,進一步對參與應激反應的兩個主要調控軸:藍斑-交感-腎上腺髓質系統及下丘腦-垂體-腎上腺皮質系統(HPA軸)進行了分析評估。比較45℃30min熱應激作用下PGD和Normal小鼠的藍斑-交感-腎上腺髓質系統,未發現藍斑區域以及腎上腺髓質的組織結構異常。同時,兩組小鼠藍斑的神經元活性,以及腎上腺髓質合成分泌的腎上腺素和去甲腎上腺素水平均無顯著差異。這些結果提示,PGD小鼠的藍斑-交感-腎上腺髓質系統在45℃高溫應激下能產生與Normal小鼠相似的反應,以適應環境的變化。另一方面,本文比較了PGD和對照小鼠HPA軸相關器官的結構和功能,證實兩組小鼠下丘腦室旁核區及腎上腺皮質的組織結構正常。進一步對下丘腦室旁核(PVN)的神經元活性進行檢測,顯示兩組小鼠PVN區c-Fos陽性的神經元數目無顯著差異,提示PGD小鼠HPA軸的中樞器官對45℃熱環境具有與Normal小鼠相似的反應能力。同時,評估了HPA軸的外周器官腎上腺皮質合成激素的功能,證實兩組小鼠腎上腺中合成激素的原料以及參與激素合成的關鍵酶表達無顯著差異,雖然PGD小鼠P450c11的mRNA水平相對于Normal小鼠偏高,但未影響腎上腺皮質最終合成分泌的皮質酮水平。上述結果提示,PGD小鼠HPA軸對45℃高溫應激能產生與Normal小鼠相似的反應。而在本課題組最近的研究中,發現PGD小鼠在-20℃30min的冷應激作用下,腎上腺皮質分泌皮質酮的水平低于Normal小鼠,提示其對-20℃冷應激的調節能力不同于Normal小鼠(資料未發表)。本研究只選取45℃這一單一的溫度作為熱應激條件,雖然顯示PGD小鼠在該條件下腎上腺調節能力與Normal小鼠無明顯差異,但仍不能排除當PGD小鼠面臨更劇烈的高溫環境時,能表現出與Normal小鼠相同的調節能力。在應激狀態下,機體通過興奮藍斑-交感-腎上腺髓質系統和下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸,引起相應激素的分泌增加,進而影響諸多器官的生理生化活動,以適應環境的變化。因此,本研究觀察到的PGD小鼠對45℃熱環境的反應調節能力異常,可能不是由于藍斑、下丘腦以及腎上腺的結構和功能差異直接造成的,而與這兩個系統最終分泌的應激激素(包括腎上腺素、去甲腎上腺素、糖皮質激素)的進一步作用有關,激素靶器官的應答水平差異可能造成兩組小鼠的不同反應。接受交感神經節后纖維支配的器官中存在著與腎上腺素、去甲腎上腺素反應的受體,稱為腎上腺素能受體。腎上腺髓質激素作用于心臟、肝、腎、動靜脈血管、肌肉、脂肪組織等,通過靶器官的腎上腺素能受體,產生復雜的作用,如心肌收縮力和興奮度增強,心輸出量增加,收縮壓升高;還促進糖原和脂肪分解,升高血糖,提供更多的能量等。雖然在45℃30min的高溫作用下,PGD小鼠和Normal小鼠的腎上腺髓質激素分泌水平沒有差異,但若諸多靶器官的激素受體數量或激素受體敏感性存在差異,可造成在