鈣離子在細胞內鈣信號傳遞機制的研究進展

鈣是植物細胞中最重要的第二信號。目前已經發現多種刺激因素,包括機械刺激(觸動和風)、低溫、紅光、植物激素、真菌激發子、缺氧、水分脅迫等,都使用細胞內鈣離子作為第二信使來介導生物學反應,鈣離子在細胞內信號傳遞中的作用是顯而易見的。鈣離子通道是鈣信號產生的重要途徑,Ca2+通過Ca2+通道自胞外和胞內貯鈣器進入細胞質造成胞質Ca2+濃度升高。正常細胞內游離鈣離子濃度為30~200nmol·L-1,比細胞外空間和細胞器內的鈣離子濃度低2~4個數量級,細胞質相對于細胞外空間和細胞器來說帶有較多的負電荷,因此在細胞質膜和細胞器膜上存在指向細胞質的鈣離子濃度和電荷梯度,這一梯度由位于這些膜系統上的鈣離子泵維持,一旦位于這些膜系統上的鈣通道打開,鈣離子即在這些梯度驅動下通過鈣通道迅速流入細胞質中,產生鈣信號。高等植物細胞中存在著許多種具有不同的空間分布和不同開放調控機制的Ca2+通道,參與各種不同的刺激-偶聯反應。不同的刺激信號通過活化不同的Ca2+通道產生具有特定時間和空間特征的Ca2+信號,保證刺激與反應之間的高度特異性。根據鈣通道在細胞內的位置,鈣通道分為兩類:位于細胞質膜上的鈣離子內流通道和位于細胞內膜上的鈣離子釋放通道。這些通道根據活化機制又可以分為3類,即電壓依賴性(voltage-dependent)、配體激活(ligand-activated)和牽張激活(stretch-activated)的鈣通道。1細胞內的鈣離子經過細胞質膜鈣通道的鈣離子內流可以在細胞內凈積累對于細胞結構和功能非常重要的鈣離子。由于跨越細胞質膜的鈣離子濃度梯度最為陡峭,在細胞受到刺激時,細胞質膜上的鈣通道打開,跨越細胞質膜的鈣離子迅速內流會明顯提高細胞內鈣離子濃度。已經在細胞質膜上發現了電壓依賴性鈣通道和牽張激活鈣通道兩類鈣離子通道。1.1正內負正內負一般說來,高等植物細胞質膜存在-120~-180mV范圍的電勢差(外正內負)。許多生理性刺激因素(如結瘤因子、生長素、脫落酸、光以及植物毒素等)都可以使植物細胞質膜電壓迅速發生變化,隨后胞質Ca2+濃度升高,產生特定反應,這些刺激因素有可能通過質膜電壓依賴性Ca2+通道完成信號轉導。1.1.1質膜預去極化誘導的電壓依賴機制在細胞質膜上最先發現的電壓依賴性鈣通道是去極化激活的。細胞質膜的去極化通常由陽離子(如鉀離子)內流引起。Thuleau等用膜片鉗技術在胡蘿卜懸浮培養細胞原生質體質膜中發現了可以由質膜去極化激活的鈣通道,這些通道對Ca2+比對K+有更高的通透性,同時表現出對Mg2+及Ba2+很高的通透性。這是第一次在高等植物細胞質膜上直接發現的電壓依賴性的鈣通道。1995年,Pineros和Tester在小麥根細胞的質膜上發現了一類電壓控制的鈣離子通道,命名為rca通道。該通道對鈣離子具有較強的選擇性,對不同陽離子的選擇性順序分別為Ba2+>Sr2+>Ca2+>Mg2+>Mn2+,也允許某些一價陽離子通過。在正常膜電壓水平下這些通道主要保持關閉狀態,只有在膜電壓發生去極化時才開放。細胞質膜上去極化激活的鈣通道活性非常不穩定,在活化之后其活性隨時間而迅速下降。如果預先進行脈沖式去極化,使細胞質膜電壓接近于0mV左右,不但可以誘導活性下降的鈣通道恢復活性,而且可以使原來處于休眠狀態的電壓依賴性鈣離子通道被激活,使跨膜電流成倍增加,這一過程稱為復原(recruiment)。復原的效果依賴于細胞質膜預去極化的強度和持續時間,預去極化的時間越長、強度越大,復原效果越明顯。預去極化到+118mV達30s,可使最初的鈣離子流動增加5~10倍,推測此類電壓依賴的鈣通道可能是由預去極化誘導的生物學機制控制的。高等植物細胞質膜上存在大量電壓依賴性鈣通道,其中主要是不活化或者處于休眠狀態的,復原可以迅速激活休眠的鈣通道,使參與信號轉導的鈣離子大量增加。這種由預去極化誘導的復原機制是細胞質膜上去極化激活的電壓依賴性鈣通道活性調節的重要因素。對于鈣通道復原機制的研究近年取得初步進展。Thion等用胡蘿卜原生質體進行的膜片鉗實驗表明,細胞骨架在電壓依賴性鈣離子通道的活性和穩定性的調節方面發揮重要作用,加入干擾微管聚合的藥物秋水仙素可以使鈣通道活性和半壽期提高(延長)6~10倍,而微管穩定劑紫杉醇對上述參數沒有明顯影響,表明細胞骨架與電壓依賴性鈣離子通道的作用抑制了通道的活性,并且縮短其半壽期,而微管骨架的解聚則消除了這種抑制作用,使通道對外界刺激的反應能力明顯加強,推測細胞骨架的變化可能介導了預去極化過程對鈣通道的激活作用。Mazars等用秋水仙素、長春花堿等微管解聚劑處理煙草原生質體,使原生質體對外界低溫刺激的反應能力明顯加強,細胞內鈣離子變化幅度明顯高于未處理細胞,對微管解聚不起作用的秋水仙素類似物對低溫刺激之后的鈣信號沒有明顯影響,表明微管骨架系統在調節鈣通道對外界刺激的敏感程度方面發揮重要作用。Thion等用擬南芥進行的實驗進一步證明,細胞骨架中的微管網絡參與細胞質膜上去極化激活的電壓依賴性鈣通道的活性調節過程。在與微管有關的基因發生變異的擬南芥突變體中,去極化激活的鈣離子通道活性要比野生型中高10倍,其半壽期也延長3倍,影響微管聚合的藥物秋水仙素在野生型中可以激活并穩定鈣通道的活性,而在突變體中則沒有作用。他們進一步用免疫細胞化學對微管蛋白進行染色發現,野生型和突變體在微管骨架網絡的基本結構以及與膜結合的微管數量上沒有明顯差別,這一結果表明,微管對鈣通道活性調節可能并非是骨架對鈣通道的直接作用,而是由在突變體中未能表達產生的某種成分介導的。1.1.2膜片鉗研究根毛端面鈣通道的意義一些刺激因素可以通過激活細胞質膜上的質子泵,質子泵驅動氫離子外流導致細胞質膜超極化,可以被超極化激活的細胞質膜電壓依賴性鈣通道也相繼發現。Gelli和Blumwald用膜片鉗技術發現番茄細胞質膜上超極化激活的鈣離子通道負責鈣離子內流,膜電壓水平超極化到低于-120mV時該通道被激活,激活程度依賴于超極化的電壓和持續時間,該通道對鈣離子具有強選擇性,可以受10μmol·L-1La3+或者100μmol·L-1尼群地平強烈抑制,對Ba2+的電導率高于鈣離子,低鈣條件下其活性很低,而高水平的細胞質鈣離子促進其活性的提高。Very和Davis用激光切除了擬南芥根毛尖端局部的細胞壁,用膜片鉗技術研究根毛尖端細胞質膜上參與尖端鈣離子內流的鈣通道的性質時發現,該鈣通道是電壓依賴性的,而且是由超極化條件激活的。該通道對鈣離子具有強選擇性,受到低于100μmol·L-13價陽離子(La3+、Al3+、Gd3+)的完全抑制,對2價陽離子的通透選擇性從強到弱依次為Ba2+>Ca2+>Mg2+,推測這種鈣通道是參與根毛尖端生長過程中鈣離子內流的固有因素。這一工作具有很重要的意義。第一,根毛的伸長生長與花粉管的尖端生長、藻類假根的伸長生長以及真菌菌絲的伸長生長都與尖端鈣離子濃度梯度有關。該梯度由位于尖端細胞質膜上的鈣離子內流引起,已經證實這一梯度是調節尖端生長的基本因素。負責尖端鈣離子內流的鈣通道的性質是人們長期關注的焦點,但是有關研究始終沒有取得突破性進展。Garrill等發現水霉菌絲生長過程中,牽張激活的鈣通道參與菌絲尖端鈣離子梯度的形成,但是高等植物尖端生長過程中鈣離子局部內流由何種因素控制一直存在疑問。Very等的實驗結果證明細胞質膜上超極化激活的鈣通道也參與鈣離子梯度的形成和維持,這一結果為今后人們研究尖端生長過程的機制提供了新的思路。第二,到目前為止,只在少數未分化的培養植物細胞內發現了超極化激活的鈣離子通道,但對這些材料中發現的鈣通道的生理功能知之甚少,而這一試驗結果巧妙地揭示了電壓依賴性鈣通道與生理反應之間的關系,是目前發現的細胞質膜超極化激活的鈣通道中唯一有比較確切生理功能的一個。第三,從研究方法的角度考慮,在用膜片鉗技術研究植物細胞質膜上鈣通道的性質時,必須去除細胞壁制成原生質體,但是由于原生質體失去了原有的細胞形態,無法確定鈣通道所在的位置,對于那些集中分布于細胞膜某個局部位置的鈣通道而言,研究起來非常困難。Very等的試驗結果無疑為今后進行類似的研究提供了方法上的啟迪。1.2機械敏感性離子通道Cosgrove和Hedrich在蠶豆細胞質膜上發現了對牽張刺激敏感的Ca2+通道。這種機械敏感性的通道具有較短的平均開放時間、較為嚴格的離子選擇性、較低的電流幅度。所有這些特性有利于對保衛細胞的體積或膨壓進行精細的調節,這些機械敏感性離子通道是其他細胞所不具備的。這暗示保衛細胞可能具有多種高度特化的機制進行監測和控制細胞體積和膨壓的變化。這對于它們作為由水分控制的調節氣體交換的閥門是至關重要的。另外一種機械敏感性鈣離子通道發現于洋蔥表皮。這種通道對牽張刺激敏感,而且該通道對牽張刺激的敏感性受溫度、電勢、生長素、酸堿度的調節。認為該通道可能普遍存在于植物界,幾乎所有細胞可能都有這種對機械敏感,能通透Ca2+的陽離子通道。近年來對此類鈣通道研究的進展不大,雖然已經發現某些刺激因素(如膨壓、觸動以及某些金屬離子等)可以導致細胞內鈣離子升高,推測他們可能會激活牽張活化的鈣離子通道,但是牽張活化的鈣通道激活導致某些生理反應的證據還不足。2植物內囊卵巢2.1胞內ca2+現有植物的液泡是細胞內貯量最大的鈣離子庫,估計其游離鈣離子水平在10-3mol·L-1左右,它是信號轉導過程中胞內Ca2+信使的重要來源。液泡膜上有可對刺激因子起反應的鈣離子通道,受刺激時釋放鈣離子到細胞質中,提高細胞質Ca2+水平。2.1.1慢液泡通道的活性采用放射性同位素和膜片鉗技術在液泡膜上發現了電壓依賴性的鈣離子通道。在液泡膜電壓接近于0mV時,該通道保持關閉狀態,在體內生理水平的電勢范圍內,在細胞質比液泡中帶有更多的負電荷(超極化)時,該通道被激活。此類通道對Ca2+的通透性超過K+,Gd3+顯著抑制其活性,降低這類通道的開放頻率,推測一些由Gd3+抑制的生理效應可能是由此類鈣通道介導的。液泡中鈣離子濃度和pH的變化可以影響該通道對膜電壓變化的敏感性。細胞質鈣離子對其活性的影響尚未確定,有人報道它對該通道的活性沒有影響,但也有報道認為具有抑制作用。Turnquist等發現含羞草葉枕細胞運動過程中背軸一側運動細胞中液泡膜上電壓依賴性鈣通道激活導致小葉合攏,異搏定明顯抑制小葉合攏反應,而鈣泵抑制劑偏釩酸鈉明顯抑制小葉復原的速度和程度,電壓依賴性鈣通道激活劑Bay-K8644可以增強實驗效果。這些現象表明液泡膜上電壓依賴性鈣通道介導了感震性運動的產生,而鈣泵則參與復原的過程。這一結果也是液泡膜上電壓依賴性鈣通道參與某些生理反應的一個具體例證。液泡膜上另外一類電壓依賴性鈣通道稱為慢液泡通道(slowk-vacuolecalciumchannel)。這是一種激活慢,失活也慢,開放時間較長的離子通道。其活性受到鈣離子、鈣調素以及液泡膜電壓的調節(去極化條件下激活,正常膜電壓和超極化條件下失活)。這種通道最初被認為是一種陰離子通道,但是已經發現在保衛細胞的液泡中選擇性地允許陽離子(如鈣離子)通過。胞質中Ca2+濃度的升高引起胞質貯鈣器中動員更多的Ca2+釋放,這種Ca2+誘導的Ca2+釋放(calciuminducedcalciumrelease,CICR)是一種能時空地擴大刺激誘導的胞質Ca2+濃度升高的正反饋機制,這一現象已在某些植物保衛細胞中觀察到。慢液泡通道的發現使人們意識到它可能在CICR過程中發揮重要作用,但是它對鈣離子的選擇性是在非生理離子濃度條件下獲取的,其通透性和選擇性在不同離子濃度下出現很大差異,因此它在這一過程中所起的作用還存在疑問。2.1.2鈣通道的激活2.1.2.促進鈣離子從液泡中釋放-activatedCa2+releasechannels)采用放射性同位素分析法在液泡膜上發現了IP3激活的鈣通道,其Km值為60nmol·L-1IP3,膜片鉗技術測定的結果對此給予了有力的支持。早在上世紀80年代末期,就已經發現在許多植物組織中,IP3可以促進鈣離子從液泡中釋放出來,但更為直接的證據則來自于甜菜上的工作。Brosnan和Sanders發現抑制IP3對鈣離子通道激活的肝素能抑制甜菜液泡膜上IP3誘導的鈣釋放;Alexandre等用膜片鉗技術在甜菜中發現IP3能夠從液泡中動員Ca2+釋放,在這個實驗中跨液泡膜電流是由IP3專一性誘導產生,而且膜片鉗記錄到的電流是由Ca2+流動引起的。這充分說明IP3是通過激活位于液泡膜上的Ca2+通道而從液泡中動員Ca2+釋放的。以后對IP3從富含液泡膜的微粒體中動員Ca2+的動力學及液泡膜上假定存在的IP3受體特性的研究表明,植物細胞也含有與動物細胞中特性極其相似的IP3受體。顯微注射IP3的結果表明,IP3可能參與氣孔開關、細胞滲透勢、運動細胞膨壓的調節以及花粉自交不親和反應等生理過程。這些實驗結果反映出IP3激活的鈣通道可能參與植物體內許多重要生理過程的調節。2.1.2.cadpr對ca2+通道活性的作用)液泡膜上發現的另一種配體激活的鈣離子通道是由cADPR(環腺苷二磷酸核糖)控制的。cADPR刺激該通道開放,提高胞質Ca2+,其Km值為20~25nmol·L-1。這一結果同樣得到了放射性同位素和膜片鉗技術的相互印證。cADPR對通道的激活作用可受釕紅抑制。這個受cADPR控制的Ca2+通道的活性有賴于液泡膜兩側生理范圍內的膜電壓,對Ca2+比對K+有更高的通透性。cADPR也是普遍存在于動物和植物體內的一種第二信使分子,顯微注射cADPR引起保衛細胞胞質Ca2+水平升高,在某些信號刺激下細胞內首先合成cADPR,從而引起細胞內鈣離子水平升高。Leckie等向保衛細胞內注射cADPR后,細胞內鈣離子濃度升高,以致氣孔關閉。Bauer等發現咖啡因誘導單細胞綠藻細胞質鈣離子產生振蕩,這一振蕩引起膜電壓的振蕩,加入咖啡因的類似物異咖啡因、茶堿、異茶堿都會導致膜電壓的振蕩,這與這些藥物在動物細胞內與cADPR受體結合后產生的效果相似,揭示在這一植物材料中可能存在著可以對cADPR起反應的受體。2.2克氏原螯蝦c9鈣通道植物細胞內質網中鈣離子濃度估計為10-6mol·L-1左右。跨越內質網膜的鈣離子流動非常活躍,快速鈣離子內流和外流之間的動態平衡維持著內質網內外鈣離子梯度的相對穩定,刺激也引起Ca2+通道開放,向胞質釋放Ca2+。Kluesener等在薯蕷卷須組織的內質網膜中發現了鈣選擇性離子通道,在50mmol·L-1的CaCl2溶液中,其單通道電導率為29pS,對鈣離子具有強選擇性,該鈣通道為電壓依賴性的。在生理條件下該通道的開放的可能性大部分由鈣離子的化學梯度控制,而鈣離子梯度由同樣位于該膜上的Ca2+-ATPase控制。該鈣通道可以被釓(Gd3+)離子有效地抑制,而Gd3+離子可以完全抑制卷須對觸動的反應,表明這一通道有可能是高等植物觸覺信號轉導途徑中鈣信號轉導途徑的關鍵成分。1999年Kluesener等又用平面脂雙層技術研究了來自擬南芥的近親獨行菜根尖細胞內膜系統中的一種鈣通道LCC1,對單通道記錄的分析表明,該通道是電壓依賴性的,而且受到嚴格的控制,對鈣離子具有高度的選擇性,并允許其他一些2價陽離子(Ba2+、Sr2+)通過。在外來刺激條件下,顯示出突然激活的特征,開放的可能性和平均開放時間也都很短。抑制劑實驗表明,該通道可以被μmol水平的藻紅B抑制,La3+和Gd3+也可以抑制其活性,而有機抑制劑異搏定則沒有阻塞效應。LCC1在調節根尖和根冠細胞中鈣離子水平中有重要作用,該鈣通道可能在向重力性產生的信號轉導途徑中也有一定的作用。有跡象表明,由IP3激活的鈣通道也可能存在于內質網中。Muir和Sanders用蔗糖密度梯度離心的方法從花椰菜組織中提取到了密度大于液泡的囊泡,其中含有大量的內質網成分,IP3可以誘導鈣離子從這些囊泡中釋放出來,推測在內質網中可能含有可以對IP3起反應的鈣通道。2.3對2價陽離子的選擇性1996年Pottosin和Schonknecht用膜片鉗技術研究了菠菜類囊體中一種電壓依賴性鈣通道開放產生的鈣離子電流。盡管這種鈣通道對1價陽離子的電導率高于2價陽離子,但是這種通道對2價陽離子的選擇性是1價陽離子的2倍,當類囊體膜的葉綠體間質一側相對于類囊體內部帶有較多正電荷時,該通道的開放能力明顯加強。由于此類鈣通道控制的是類囊體內液與葉綠體間質之間的鈣離子交換,它在信號轉導中是否起作用還有待研究。3抑制劑實驗實驗目前植物鈣通道的研究仍然處于初級階段,大多數的實驗結果都是來自于抑制劑的實驗。廣泛使用的有兩大類抑制劑,即無機抑制劑和有機抑制劑。除了這些被認為可以直接作用于鈣通道的抑制劑之外,還有一些間接抑制鈣信號產生的藥劑(如肝素)也廣泛使用,但在此不作介紹。3.1價金屬離子nmf抑制檢測許多金屬離子抑制鈣離子流動,如μmol水平的La3+、Gd3+、Al3+可以減弱原生質體的鈣離子流動,以及細胞質膜和液泡膜囊泡上的鈣離子流動。在有鋁離子存在條件下,細胞質膜上牽張激活的鈣通道受到抑制,來自內質網和液泡膜上的電壓依賴性鈣通道受到μmol水平Gd3+的抑制。某些2價金屬離子(如Ni2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+)也可以抑制細胞質膜和液泡膜上的鈣離子流動。這些陽離子的阻塞作用一般都是可逆的,這可能反映了兩類對作用位點具有類似親合性的離子之間的競爭。3.2異博弈定和紅由于對植物細胞內的鈣通道的結構和功能了解還很少,目前主要還是用動物細胞鈣通道研究中經常使用的調節鈣通道活性的有機物研究植物鈣通道的活性和功能。這些藥物對植物生理生化反應的影響,常常推定是它們對鈣通道活性的影響造成的,而這些鈣通道分子中是否有這些藥劑的高親和力結合位點,它們除了直接影響鈣通道活性之外是否還會影響其他生理反應,則還都存在疑問。常用的有機抑制劑主要有兩類:一種是苯氨基醇類化合物,如異搏定和D600,另一類是二氫吡啶類化合物,如尼群地平。抑制植物的鈣通道比抑制動物細