扁穗牛鞭草減數(shù)分裂期胞質(zhì)異常分析

c-hematachirep.br.是水稻科的一種多年生草本植物，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)。作為典型的暖季型禾草,扁穗牛鞭草具有強大的克隆繁殖能力,但有性生殖能力弱,野生或人工栽培條件下結實率很低[1~3],這就限制了扁穗牛鞭草的進一步推廣應用。對此,國內(nèi)外學者從不同角度進行了大量研究[4~9]。傅鮮桃等研究發(fā)現(xiàn),‘廣益’扁穗牛鞭草已萌發(fā)的花粉管尖端分叉、盤繞在柱頭表面及尖端膨大等異常現(xiàn)象對自交親和性有很大影響;陳靈鷙等認為,溫度、濕度等外界因子對扁穗牛鞭草柱頭可授性影響較大;此外,研究表明花粉散布特性與專性遠交繁育系統(tǒng)之間的矛盾也會影響扁穗牛鞭草結實率。但關于限制扁穗牛鞭草結實率的生殖生物學因素的研究較少,本研究以不同倍性扁穗牛鞭草為研究對象,采用常規(guī)石蠟切片法和光學顯微技術對小孢子發(fā)生與雄配子發(fā)育進行研究,利用常規(guī)壓片法對小孢子母細胞減數(shù)分裂過程進行觀察,以期為扁穗牛鞭草的生殖生物學研究提供基本資料,也為探求扁穗牛鞭草天然種群結實率低的胚胎學因素提供科學依據(jù)。1材料和方法1.1試驗材料供試材料種植于四川農(nóng)業(yè)大學草學基地,分別為扁穗牛鞭草四倍體野生材料H052和六倍體栽培品種‘廣益’。1.2測試方法1.2.1未制備織物5份2009~2011年每年7月中下旬至8月下旬,于扁穗牛鞭草抽穗期采集不同倍性不同發(fā)育時期材料未開花花序各50份。取中上部小花用FAA固定液(50%乙醇89ml、冰乙酸6ml、37%甲醛5ml)固定,愛氏(Ehrlich’s)蘇木精整體染色法染色(蘇木精1g溶于95%乙醇25ml、冰醋酸5ml、甘油50ml、硫酸鋁鉀5g、蒸餾水50ml),常規(guī)石蠟切片法制片。1.2.2整體染色23d于孕穗期收集供試材料花序各100枚,卡諾固定液(無水乙醇∶冰乙酸體積比3∶1)固定2h后經(jīng)過95%、80%、70%乙醇處理,轉入蘇木精染液中整體染色2~3d。染色后在解剖鏡下剝離小花外稃,手術刀橫切花藥釋放內(nèi)容物,鑷子取走多余雜質(zhì)后蓋上蓋玻片,于Leica2000顯微鏡100倍視野下觀察扁穗牛鞭草花粉母細胞減數(shù)分裂過程。1.2.3不同倍性材料對花粉萌發(fā)的影響采用棉藍-乳酸-酚染色法(苯胺藍1g溶于下列配比的乳酸苯酚混合液中:乳酸25ml、苯酚25ml、甘油25ml、蒸餾水25ml)對不同倍性材料自花、異花授粉后15min、30min、1h、2h、3h、4h、5h的花粉在柱頭上的萌發(fā)生長情況進行觀察(室溫27℃條件下)。2結果與分析2.1小菌株的發(fā)生和雄配子的結構和發(fā)育2.1.1花粉母細胞減數(shù)分裂期k花粉涂片觀察發(fā)現(xiàn),六倍體扁穗牛鞭草‘廣益’和四倍體H052花粉母細胞減數(shù)分裂過程一致。花粉母細胞減數(shù)分裂經(jīng)細線期、偶線期進入粗線期(圖1-A)。由于同源染色體的聯(lián)會配對,二價體繼續(xù)螺旋化變短加粗,逐漸可辨別染色體首尾。隨后進入雙線期,非姊妹染色體單體之間發(fā)生片段互換。進入終變期二價體高度濃縮,交叉端化,中間交叉數(shù)目減少,呈現(xiàn)出粗短的“棒狀”形態(tài),核仁變小并逐漸消失,二價體分散于核膜內(nèi)緣,形態(tài)清晰可見(圖1-B)。花粉母細胞減數(shù)分裂中期Ⅰ染色體在細胞板上呈“一字型”排列,并相互重疊(圖1-C)。后期Ⅰ聯(lián)會的染色體彼此分開,在紡錘絲的牽引下向兩極移動(圖1-D)。后期Ⅰ染色體數(shù)目減半,形成二分體。第一次減數(shù)分裂完成后快速經(jīng)過前期Ⅱ(圖1-E)和中期Ⅱ,進入后期Ⅱ。二分體細胞的姊妹染色單體分離,每個染色體上的兩個單體分開,移向細胞兩極,此時可見細胞內(nèi)四組染色體和兩組紡錘絲(圖1-F)。染色單體達到兩極后開始解螺旋,當新的核膜、核仁形成時立即進入四分體時期。此時,染色體單體完成解螺旋,子細胞中央形成細胞板,新的核膜、核仁形成,最終形成四分體(圖1-G)。扁穗牛鞭草花粉母細胞減數(shù)分裂完成后,形成十字形排列的左右對稱型四分體。大量涂片觀察發(fā)現(xiàn),六倍體扁穗牛鞭草‘廣益’和四倍體H052花粉母細胞減數(shù)分裂過程中均存在異常狀況,主要表現(xiàn)在第二次減數(shù)分裂后期胞質(zhì)分裂不同步(圖1-H)。對異常現(xiàn)象統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn),六倍體材料異常率為22.58%,遠大于四倍體材料的3.41%,說明四倍體材料H052花粉母細胞減數(shù)分裂過程基本正常,而六倍體‘廣益’異常率較高。2.1.2小培養(yǎng)和生殖細胞四倍體H052和六倍體‘廣益’雄配子發(fā)育過程基本一致。隨著胼胝質(zhì)溶解消失,小孢子被釋放。當小孢子細胞質(zhì)出現(xiàn)許多小液泡,逐漸匯合成大液泡時,小孢子體積顯著增大。伴隨著小孢子液泡出現(xiàn),小孢子表現(xiàn)出一定極性,首先核從中央移到一側,隨后小孢子在藥室內(nèi)定向排列,即規(guī)則地沿著花藥壁排列,細胞核均固定于花藥腔一側,遠離絨氈層,與萌發(fā)孔相對,為單核靠邊期(圖2-A)。小孢子核減數(shù)分裂后形成含有1個營養(yǎng)核和1個生殖核的二核花粉粒。兩核剛形成時靠近,隨后營養(yǎng)核向萌發(fā)孔移動,且逐漸增大。二核細胞花粉內(nèi)液泡逐漸消失,營養(yǎng)核積累營養(yǎng)物質(zhì),花粉壁加厚,形成一對精子(圖2-B)。生殖細胞分裂未見細胞板產(chǎn)生,胞質(zhì)分裂屬于縊縮方式。精子形如橄欖,后變?yōu)樵卵佬巍擅毒釉诔墒旎ǚ壑袥]有固定的排列位置,有時還互成一定角度(圖2-C)。2.1.3單子葉型分布特點孢原細胞第一次平周分裂向外產(chǎn)生的初生壁細胞發(fā)育為藥室內(nèi)壁,初生造孢細胞再經(jīng)一次平周分裂形成次生壁細胞,次生壁細胞經(jīng)一次平周分裂形成中層和絨氈層。次生造孢時,藥壁分化完成,發(fā)育完全的藥壁可分為表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層(圖2-D)。按Davis劃分標準,扁穗牛鞭草花藥壁發(fā)育類型為單子葉型。藥壁發(fā)育隨小孢子發(fā)生、雄配子體的發(fā)育而進行。表皮細胞在發(fā)育過程中進行垂周分裂以適應內(nèi)部組織變化,逐漸拉長且具角質(zhì)層。中層細胞在整個發(fā)育過程中逐漸解體。絨氈層細胞較外圍藥壁細胞大,細胞質(zhì)濃,液泡少而小,具有腺細胞的特征。小孢子母細胞減數(shù)分裂后期,絨氈層細胞開始退化。小孢子單核靠邊期,絨氈層細胞質(zhì)幾乎完全消失并開始出現(xiàn)纖維狀加厚(圖2-D)。纖維狀加厚在花粉粒成熟時達到最高峰,藥壁只有一層,表皮已破裂(圖2-E)。大量切片觀察發(fā)現(xiàn),四倍體H052花藥壁發(fā)育基本正常,而六倍體‘廣益’小孢子發(fā)育過程中絨氈層解體較多,占所觀察切片數(shù)的15%左右(圖2-F,圖2-G)。2.2花粉管生長速度四倍體材料花粉被柱頭捕捉后立即萌發(fā),15~30min后可觀察到花粉管前端進入柱頭表面的乳突細胞(圖3-A)。隨著花粉粒在柱頭上停留時間增長,萌發(fā)花粉數(shù)逐漸增加。授粉后2h內(nèi),花粉管生長較快(圖3-B),2h后花粉管生長速度減緩。四倍體材料花粉管生長正常,伸入胚囊釋放精細胞。六倍體植株花粉在柱頭上附著,萌發(fā)緩慢,花粉管不伸入柱頭乳突細胞,盤繞在柱頭表面(圖3-C),即使伸入柱頭也會中途萎縮死亡停止生長,無法伸入胚囊釋放精細胞(圖3-D)。3花粉母細胞減數(shù)分裂規(guī)律及與小合成關系Davis對禾本科植物胚胎發(fā)育基本特征做了全面總結,扁穗牛鞭草小孢子發(fā)生與雄配子體的發(fā)育與其描述基本相符:小孢子母細胞減數(shù)分裂過程的胞質(zhì)分裂為連續(xù)型,四分體為左右對稱型。成熟花粉為三細胞型,具單萌發(fā)孔;花藥壁發(fā)育為單子葉型,腺質(zhì)絨氈層。Wilms對不同倍性的牛鞭草(H.altissima)花粉粒發(fā)育情況進行了研究,表明所有倍性的牛鞭草均能產(chǎn)生數(shù)量較多的可見花粉粒。本研究通過常規(guī)石蠟切片法對四倍體扁穗牛鞭草H052、六倍體扁穗牛鞭劃‘廣益’小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育過程進行對比,并對照水稻、羊草、小麥、星星草(Puccinelliatenuiflora)等禾本科植物胚胎學發(fā)育過程后判斷,‘廣益’與H052小孢子發(fā)生與雄配子體發(fā)育過程相似。Quesenberry對二倍體和四倍體牛鞭草材料花粉母細胞減數(shù)分裂規(guī)律進行了研究,發(fā)現(xiàn)二倍體牛鞭草花粉母細胞減數(shù)分裂過程比較規(guī)則,而四倍體牛鞭草存在極少的染色體落后現(xiàn)象。本研究并未在四倍體H052花粉母細胞減數(shù)分裂中觀察到染色體落后現(xiàn)象,而在六倍體‘廣益’花粉母細胞的第二次減數(shù)分裂進行到中后期時,觀察到胞質(zhì)分裂不同步現(xiàn)象,出現(xiàn)頻率達22.58%。花藥壁發(fā)育正常與否,直接關系到小孢子育性。大量研究表明,由于絨氈層的發(fā)育異常往往導致小孢子敗育。根據(jù)現(xiàn)有文獻,未見對牛鞭草屬植物花藥壁發(fā)育的詳盡報道。本研究發(fā)現(xiàn),兩份材料具有相似的花藥壁結構與發(fā)育過程,但‘廣益’絨氈層細胞在小孢子母細胞減數(shù)分裂時期提前退化或崩解現(xiàn)象占觀察切片15%左右。本研究雖未對絨氈層出現(xiàn)異常后小孢子的表現(xiàn)進行觀察,但由于絨氈層在小孢子整個發(fā)育過程中有營養(yǎng)供給作用,如果絨氈層提前退化崩解,小孢子正常發(fā)育將受到嚴重影響。導致小孢子發(fā)育異常的原因很多。有研究認為,小孢子母細胞減數(shù)分裂異常影響了小孢子和絨氈層之間的協(xié)調(diào)性而導致不育。Zhang等認為,小孢子母細胞不能進行正常對稱的減數(shù)分裂是由核仁異常定位造成的。謝潮添認為,小孢子敗育是由于不育基因影響了小孢子母細胞減數(shù)分裂后的細胞周期調(diào)控,使小孢子提前進入下輪細胞周期。李揚漢等認為,小孢子發(fā)育異常或絨氈層發(fā)育異常是由于在發(fā)育期間受了溫度、濕度、光照等環(huán)境條件的影響。康向陽也認為,環(huán)境條件可以導致絨氈層組織結構異常,從而使花粉敗育。Suzuki等觀察了高溫下絨氈層細胞的超微結構,并發(fā)現(xiàn)高溫可以影響絨氈層細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結構,導致絨氈層的提前降解并使花粉敗育。本研究中兩份材料均種植在同一環(huán)境條件下,H052花粉母細胞減數(shù)分裂正常,而‘廣益’異常情況較多,這說明環(huán)境條件不是導致‘廣益’小孢子和絨氈層發(fā)育異常的關鍵因素。程杏安等認為,敗育和異常的不同在于:敗育是由于小孢子結構和功能異