膝溝藻毒素對麻痹性貝毒毒性的早期預測指標

麻痹性病毒（cp）是目前已知的海洋藻類中最常見的中毒類型，對人類影響最大。中國東海和南海海域尤其是東海海域，報告了許多由有毒貝類引起的中毒事件。紅色浪潮藻類的毒性篩選方法是先進的生物育種方法。經過20多年的發展，它形成了多種過濾技術，如化學法、免疫法、細胞內毒性法等。每個篩選方法都有各自的優缺點，但不能進行初步預測。無論對個體的影響多復雜，還是對最終的影響如何，初始作用都是從細胞的分子水平開始的，并逐漸反映在細胞、器官、個體、群落、群落和生態系統的各個層面。因此，從分子水平篩選赤潮毒素的毒性具有初步預測價值。我們使用低劑量和短期使用的膝溝藻類毒素gtx-1.4（psp的主要成分之一）來測量大鼠腦中乙酰膽堿（ach）、no的含量，以及乙酰膽堿酯酶（ache）和氧氮化酶（nos）的活力，探索急性暴露后信息的分子傳輸機制，為找到初評價psp毒性信息提供重要依據。1材料和方法1.1標準品和試劑實驗動物,健康的ICR品系成年小鼠,體重25～30g,由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供;GTX-1,4標準品,購于加拿大海洋生物研究所;硫代ACh(ASCh,w=99%)、雙硝基二硫代苯甲酸(DTNB,w=99%)、還原型谷胱甘肽(w=98%)、硫酸毒扁豆堿均購于德國Merck公司;NO和NOS試劑盒購于南京建成生物工程研究所.1.2兩組暴露時間比較動物暴露,將動物分為6組,每組只數n=5.暴露組腹腔注射體重劑量為1μg/kgGTX-1,4,對照組注射等量溶劑,暴露時間分別為60,90,120min.1.3各指標的測定ACh含量測定采用堿性鹽酸羥胺測定法,AChE活力測定采用改良Ellman法,NO含量和NOS活力的測定依據試劑盒要求進行.1.4統計分析采用SPSS11.0軟件進行t檢驗和協方差分析.2結果2.1對小鼠腦中ach含量的影響由表1可見(其中:xˉxˉ為平均值;SD為標準方差),GTX-1,4暴露60min時暴露組ACh含量顯著升高(P<0.01),90min時顯著下降(P<0.05),120min時沒有明顯變化(P>0.05).協方差分析的結果顯示,90、120min小鼠腦中Ach含量與60min值均存在顯著差異(P<0.01),與90min相比,120min值顯著升高(P<0.05).隨著時間的延長,小鼠腦中ACh含量呈先降低后升高的趨勢,并且具有統計學顯著性,至120min時暴露組與空白組沒有顯著變化.GTX-1,4暴露60min時小鼠腦中AChE活力變化空白組與暴露組沒有明顯差別(P>0.05),在90min活力明顯下降(P<0.05),120min空白組與暴露組無顯著差別(P>0.05).偏方差分析的結果顯示,暴露90、120min小鼠腦中AChE含量與60min值的差異沒有統計學顯著性,120與90min也沒有顯著差異(P>0.05).2.2nos活力變化由表2可見,暴露60、90、120min時暴露組腦中NO含量均無顯著變化(P>0.05).協方差分析的結果表明,90、120min均顯著低于60min(P<0.01),90與120min之間沒有明顯的差別.說明暴露組腦中NO含量先升高,后下降,但沒有持續性.暴露60、90min染毒組與空白組相比腦中NOS活力均沒有顯著差異(P>0.05),120min暴露組顯著下降(P<0.01).協方差分析結果表明,90min時暴露組NOS活力明顯低于60min(P<0.05),90與120min不存在顯著差別(P>0.05).說明隨著暴露時間的延長,暴露組NOS活力呈現降低趨勢,至120min表現出與空白組顯著的差別.3麻醉性貝毒對大鼠腦中c-fos基因表達的影響麻痹性貝毒屬于神經毒素,能選擇性、高親和地結合Na+通道蛋白,阻斷Na+內流,阻礙動作電位的形成.在正常情況下,大量Na+從細胞外液流入胞內,導致膜電位升高,即去極化.當膜電位去極化至一定程度引起Ca2+通道開放,使Ca2+內流,以及K+通道的開放使細胞重新復極化,麻痹性貝毒阻斷了這一過程的發生.ACh作為細胞外的信號分子,儲存于囊泡中,神經活動興奮期,Ca2+進入細胞產生興奮釋放偶聯,使囊泡與突出前膜結合,胞裂釋放ACh,釋放至突觸間隙的ACh絕大部分被AChE水解.60min時暴露組ACh含量的顯著升高可能是由于PSP的毒性作用抑制了其在激活狀態下的釋放,導致了短時間該物質的累積.PSP還影響了ACh的基礎釋放,毒性作用開始由于ACh激活狀態下的釋放被抑制其含量升高,但是隨著時間的延長,ACh逐漸消耗,而相應的基礎釋放卻被抑制,導致ACh含量下降.但是PSP的毒性作用在本實驗中沒有觀察持續效應,在120min時暴露組腦中ACh含量已經與空白組無明顯差別.ACh的水解酶AChE活力敏感性低于ACh,只在90min時觀察到AChE活力低于空白組,差異具有統計學意義(P<0.05),但是這種降低并沒有持續作用,在120min時酶活力又恢復正常值.GTX-1,4急性暴露實驗結果說明,麻痹性貝毒影響了膽堿能神經遞質的釋放,表明GTX-1,4對神經信號傳導系統中第一信使——膽堿能神經遞質有毒性作用.乙酰膽堿與神經系統的學習記憶、感覺運動等功能都有密切的關系.劉潔生等的研究結果也表明,低水平長期攝入PSP毒素對大鼠學習記憶能力及肌肉運動耐力可造成一定程度的損害.實驗結果表明,GTX-1,4可影響腦中NOS活力,但是對NO含量沒有顯著影響.隨著染毒時間的增加,腦中NOS活力逐漸降低,120min明顯低于空白組.說明GTX-1,4對腦中NOS活力的影響與暴露持續時間有關.以上現象可能與刺激因素增強引起的機能代償有關,當機能的代償能力達到極限后,再度引起降低.NOS活力的代償性增高和失代償性降低都是非正常狀態.NOS是合成NO的關鍵酶,NOS活力的降低將會導致NO含量的減少,表現出兩者的正相關性.實驗結果表明,NOS活力與NO含量是正相關關系.通過以上分析認為,GTX-1,4對腦中NOS的影響更加顯著,并表現出時間效應關系.NO遞質在體內具有第二信使的作用,實驗結果表明麻痹性貝毒影響了小鼠體內第二信使的正常生理功能.有研究表明,麻痹性貝毒急性暴露60min就觀察到魚腦中c-fos基因表達的顯著降低,與麻痹性貝毒具有類似致毒機理的河豚毒素抑制了小鼠大腦皮層、視覺系統以及紋狀體中c-fos基因表達.由此可見,麻痹性貝毒能夠對動物體內神經信號傳統的第三信使起抑制作用.Andrinolo等研究STX對成年貓的毒性作用,結果表明只有在濃度較高時STX才能透過血腦屏障進入大腦,實驗中使用的標準毒素與STX具有相同的致毒機理,在低劑量短時間內可能尚未進入小鼠腦中,但是在短時間內已經出現了膽堿能遞質的變化,這說明毒素的毒性作用可能通過信號傳導機制作用到大腦.與赤潮藻毒素毒性檢測其他方法比較,目前通用的小白鼠法能在較短時間(15min左右)內確定毒素的毒性,但是需要在較高濃度下暴露,敏感性比較差;液相色譜法分析貝類中藻毒素含量的分析過程復雜,需要專業的操作人員;酶聯免疫技術具有快速、靈敏的優點,但是費用較高.本文主要依據PSP的半數致死濃度LD50,小鼠腹腔注射的半數致死量為10μg/kg,選定1/10的LD50(i.p.),即1μg/kg,作為暴露濃度,而暴露時間節點的選擇主要依據攝入PSP后出現麻痹癥狀的時間以及PSP在哺乳動物體內的代謝規律.一般情況下PSP攝入0.5～2h開始出現癥狀,PSP在體內的生命半衰期為90min.所以在實驗中選擇癥狀出現的時間60、120min,以及生命半衰期90min作為暴露時間.本文通過觀察神經遞質及過氧化損傷指標的變化,在低劑量(1/10LD5