第4章分子發光分析（MolecularLuminescenceAnalysis）4.1分子熒光及磷光分析一、基本原理

1.分子能級、熒光及磷光的產生

2.去活化過程

3.定性分析

4.影響熒光及熒強度的因素

5.定量分析二、熒光儀器三、磷光分析

1.磷光的特點：

2.低溫熒光

3.室溫熒光

4.磷光儀器熒光：16世紀：在礦物和植物提取液中發現熒光；1575年：Monardes——植物愈創木切片黃色水溶液——天蘭色熒光；1852年：Stokes闡明熒光發射機制（分光計觀測奎寧和葉綠素的熒光，發現波長稍長于入射光的波長——認識到熒光為“重新發光”而不是漫射光；1905年：Wood發現氣體分子的共振熒光；1926年:Gaviola直接測定了熒光壽命；1923年：熒光X射線光譜；1964年：原子熒光光譜分析的建立；1965年：熒光分析在生物分析中廣泛應用；磷光：15世紀被發現（重晶石在強烈陽光下的發光）1944年：Lewis提出磷光用于分析的可能性；1957年：Keirs將磷光分析用于定量分析及多組份混合物分析；1963年：廣泛用于血液及尿液中痕量藥物及農藥殘留量分析；特點：靈敏度高（1-100ppb)：有的可達0.01ppb。WHY??熒光靈敏度除待測物濃度有關外，還與入射光強度及光度計靈敏度有關；選擇性好方法簡單快速，用樣量少應用不太廣泛。4.1分子熒光分析及磷光分析一、基本原理分子發光：處于基態的分子吸收能量（電、熱、化學和光能等）被激發至激發態，然后從不穩定的激發態返回至基態并發射出光子，此種現象稱為發光。發光分析包括熒光、磷光、化學發光、生物發光等。物質吸收光能后所產生的光輻射稱之為熒光和磷光。1.分子能級、熒光及磷光的產生分子能級=電子能級(Ee)+振動能級(Ev)+轉動能級(Er)。其中電子能級包含振-轉能級，如圖。基態：電子自旋配對，多重度=2s+1=1，為單重態，以S0表示。激發單重態：分子吸收能量，電子自旋仍然配對，為單重態，稱為激發單重態，以S1，S2…表示激發三重態：分子吸收能量，電子自旋不再配對，為三重態，稱為激發三重態，以T1，T2….表示。三重態能級低于單重態（Hund規則）2.去活化過程（Deactivation）

處于激發態分子不穩定，通過輻射或非輻射躍遷等去活化過程返回至基態。這些過程包括：1）振動弛豫（VibrationalRelaxation,VR）在液相或壓力足夠高的氣相中，處于激發態的分子因碰撞將能量以熱的形式傳遞給周圍的分子，從而從高振動能層失活至低振動能層的過程，稱為振動弛豫。2）內轉換（InternalConversion，IC）對于具有相同多重度的分子，若較高電子能級的低振動能層與較低電子能級的高振動能層相重疊時，則電子可在重疊的能層之間通過振動耦合產生無輻射躍遷，如S2-S1；T2-T1。3）外轉換（ExternalConversion，EC）受激分子與溶劑或其它分子相互作用發生能量轉換而使熒光或磷光強度減弱甚至消失的過程，也稱“熄滅”或“猝滅”。4）系間跨躍（IntersystemConversion，ISC）系間跨躍是發生在兩個不同多重態之間的無輻射躍遷，如從S1到T1，該躍遷是禁阻的。然而，當不同多重態的兩個電子能層有較大重疊時，處于這兩個能層上的受激電子的自旋方向發生變化，即可通過自旋-軌道耦合而產生無輻射躍遷，該過程稱為系間跨躍。

5）熒光發射分子電子從單重激發態（Kasha規則）的最低振動能級在很短時間（10-9-10-6s）躍遷到基態各振動能層時所產生的光子輻射稱為熒光。由于各種去活化過程的存在，熒光輻射能通常要比激發能量低，或者說，熒光波長大于激發波長（Stokes效應）。6）磷光發射從單重態到三重態分子間發生系間跨躍躍遷后，再經振動弛豫回到三重態最低振動能層，最后，在10-4-10s內躍遷到基態的各振動能層所產生的輻射。3.定性分析任何熒（磷）光都具有兩種特征光譜：激發光譜與發射光譜。它們是熒（磷）光定性分析的基礎。1）激發光譜改變激發波長，測量在最強熒（磷）光發射波長處的強度變化，以激發波長對熒光強度作圖可得到激發光譜。激發光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經校正后二者完全相同！這是因為分子吸收光能的過程就是分子的激發過程。激發光譜可用于鑒別熒光物質；在定量時，用于選擇最適宜的激發波長。2）發射光譜發射光譜即熒光光譜。一定波長和強度的激發波長輻照熒光物質，產生不同波長的強度的熒光，以熒光強度對其波長作圖可得熒光發射光譜。由于不同物質具不同的特征發射峰，因而使用熒光發射光譜可用于鑒別熒光物質。如右圖所示。激發光譜熒光光譜磷光光譜3）激發光譜與發射光譜的關系i）波長比較與激發（或吸收）波長相比，熒光發射波長更長，即產生所謂Stokes位移。（振動弛豫失活所致）ii）形狀比較熒光光譜形狀與激發波長無關。盡管分子受激后可到達不同能層的激發態，但由于去活化（內轉換和振動弛豫）到第一電子激發態的速率或幾率很大，好像是分子受激只到達第一激發態一樣。換句話說，不管激發波長如何，電子都是從第一電子激發態的最低振動能層躍遷到基態的各個振動能層。iii）鏡像對稱通常熒光光譜與吸收光譜呈鏡像對稱關系。解釋1：能層結構相似性熒光為第一電子激發單重態的最低振動能層躍遷到基態的各個振動能層而形成，即其形狀與基態振動能級分布有關。吸收光譜是由基態最低振動能層躍遷到第一電子激發單重態的各個振動能層而形成，即其形狀與第一電子激發單重態的振動能級分布有關。由于激發態和基態的振動能層分布具有相似性，因而呈鏡像對稱。S1S0解釋2：位能曲線（Frank-Condon原理）

由于電子吸收躍遷速率極快（10-15s），此時核的相對位置可視為不變（核較重）。當兩個能層間吸收躍遷的幾率越大，其相反躍遷的幾率也越大，即產生的光譜呈鏡像對稱。4.影響熒光及熒光強度的因素產生并可觀察到熒光的條件：i）分子具有與輻射頻率相應的熒光結構（內因）；ii）吸收特征頻率的光后，應可產生具一定量子效率的熒光。即量子效率

足夠大：可見，凡是使kF增加，使其它去活化常數降低的因素均可增加熒光量子產率。通常，kF由分子結構決定（內因），而其它參數則由化學環境和結構共同決定。下面討論影響熒光及強度的因素。

1）躍遷類型：通常，具有

—*及n—*躍遷結構的分子才會產生熒光。而且具

—*躍遷的量子效率比n—*躍遷的要大得多（前者大、壽命短、kISC小）。2）共軛效應：共軛度越大，熒光越強。3）剛性結構：分子剛性（Rigidity）越強，分子振動少，與其它分子碰撞失活的機率下降，熒光量子效率提高。

如熒光素（大）與酚酞（=0）；芴（=1）與聯苯（=0.18）。4）取代基：

給電子取代基增強熒光（p-共軛），如-OH、-OR、

-NH2、-CN、NR2等；吸電子基降低熒光，如-COOH、

-C=O、-NO2、-NO、-X等；重原子降低熒光但增強磷光，如苯環被鹵素取代，從氟苯到碘苯，熒光逐漸減弱到消失，該現象也稱重原子效應。內因5）溶劑效應：溶劑極性可增加或降低熒光強度（改變

—*及

n—*

躍遷的能量）；與溶劑作用從而改變熒光物質結構來增加或降低熒光強度。6）溫度：溫度增加，熒光強度下降（因為內、外轉換增加、粘度或“剛性”降低）。因此體系降低溫度可增加熒光分析靈敏度。7）pH值：具酸或堿性基團的有機物質，在不同pH值時，其結構可能發生變化，因而熒光強度將發生改變；對無機熒光物質，因pH值會影響其穩定性，因而也可使其熒光強度發生改變。8）內濾光和自吸：體系內存在可以吸收熒光的物質，或熒光物質的熒光短波長與激發光長波長有重疊，均可使熒光強度下降，稱為內濾光；當熒光物質濃度較大時，可吸收自身的熒光發射，稱為熒光自吸。9）熒光猝滅：碰撞猝滅；靜態猝滅；轉入三重態的猝滅；電子轉移猝滅；自猝滅。5.定量分析二、熒光儀器（光源與檢測器處于相互垂直的位置）第一單色器或濾光片記錄儀第二單色器或濾光片熒光光源激發樣品池1）光源：氙燈、高壓汞燈、激光；2）樣品池：石英（低熒光材料）；3）兩個單色器：選擇激發光單色器；分離熒光單色器；4）檢測器：光電倍增管。熒光分析的特點：靈敏度高：視不同物質，檢測下限在0.1~0.001g/mL之間。可見比UV-Vis的靈敏度高得多！WHY？選擇性好：可同時用激發光譜和熒光發射光譜定性。結構信息量多：包括物質激發光譜、發射光譜、光強、熒光量子效率、熒光壽命等。應用不廣泛：主要是因為能發熒光的物質不具普遍性、增強熒光的方法有限、外界環境對熒光量子效率影響大、干擾測量的因素較多。三、磷光分析1.磷光的特點：

磷光波長比熒光的長(T1<S1)；

磷光壽命比熒光的長(磷光為禁阻躍遷產生，速率常數小)；

磷光壽命和強度對重原子和氧敏感(自旋軌道耦合，使kISC增加)。2.低溫磷光（液氮）由于磷光壽命長，T1的非輻射躍遷（內轉換）幾率增加，碰撞失活（振動弛豫）的幾率、光化學反應幾率都增加，從而降低磷光強度。因此有必要在低溫下測量磷光。同時要求溶劑：易提純且在分析波長區無強吸收和發射；低溫下形成具足夠粘度的透明的剛性玻璃體。常用的溶劑：

EPA——乙醇+異戊烷+二乙醚（2+2+5）

IEPA——CH3I+EPA（1+10）。3.室溫磷光低溫熒光需低溫實驗裝置且受到溶劑選擇的限制，1974年后發展了室溫磷光（RTP）。1）固體基質：在室溫下以固體基質（如纖維素等）吸附磷光體，增加分子剛性、減少三重態猝滅等非輻射躍遷，從而提高磷