11儀器分析供藥學類、中藥學類、制藥工程及相關專業使用全國普通高等中醫藥院校藥學類專業“十三五”規劃教材（第二輪規劃教材）22第十二章經典液相色譜法（LC）3經典液相色譜法

LC31.平面色譜法概述4平面色譜法基本原理薄層色譜法紙色譜法第六節

平面色譜法4平面色譜法是指固定相呈平面狀態的色譜法。平面色譜法與柱色譜法的分離機理基本相同，操作方式有所區別。經典柱色譜法的固定相填充于柱管中，流動相靠重力作用流經固定相，分離過程稱為洗脫，流動相也稱洗脫劑；而平面色譜固定相涂布于平面載板上或以紙纖維為平面載體，流動相通過毛細作用流經固定相，分離過程稱為展開，流動相也稱展開劑。本節主要介紹薄層色譜5

法與紙色譜法。5一、平面色譜法概述二、平面色譜基本原理·1.比移值（retardation

factor；Rff））圖1

2-8平面色譜展開示意圖實際操作中，待測組分Rf

在0.2

~

0.8為宜。2.Rf與k的關系667·

可見Rf即柱色譜中的保留比R。7·

組分的k↑，在薄層上移動速度↓，Rf

↓。若組分k為0，其Rf

=1，表示該組分完全不被固定相保留；若k為無窮大，其Rf=0，表示該組分在流動相中濃度為0，完全被固定相保留，停留在原點，不能被展開。3.影響Rf值的因素影響最大的是固定相、流動相、組分的性質及溫度等，此外，當用同一種固定相、流動相系統時，被測物質Rf

值還受下列因素的影響：：①固定相厚度。②展開距離。③展開容器中展開劑蒸汽的飽和程度。④樣品量。⑤操作時的環境濕度和吸附劑含水量。4.相對比值（relative

retardation

factor，Rst）Rst是在一定條件下，待測組分比移值（Rf(i)）與參考物質比移值（R

)）之比：f(s·

式中，Li，Ls分別為原點至待測組分i和參考物質s斑點中心距離。Rst與Rf相比具有更好重現性和可比性。參考物質可以選擇純物質加到試樣中，也8

可以是試樣中的某一已知組分。Rst可以大于1，也可以小于1。89三、薄層色譜9固定相涂布于平面載板上，流動相通常是借毛細管作用流經固定相，使被分離后的物質保留在固定相上。—開放式的離線操作。見圖示特點適用于微量分析（微克級）；儀器簡單，操作方便，靈敏度高，分析快速；具有多路柱效應，可同時平行分離多個樣品；分離樣品所需展開劑少，節約溶劑，減少了污染薄層色譜（TLC）nextback（一）概述．定義：將固定相均勻涂布在表面光滑的平板 上，形成薄層而進行色譜分離和分析的方法．操作過程：見圖示鋪板→活化→點樣→展開→定位(定性)/洗脫(定量)3．分類：分離機制吸附、分配、離子交換、空間排阻經典薄層色譜（TLC）、高效11

薄層色譜（HPTLC）、膠束薄層色譜（MTLC）next111212（二）吸附劑的選擇13根據被測物極性和吸附劑的吸附能力被測物極性強——活性低的吸附劑被測物極性弱——活性高的吸附劑選擇吸附劑主要依據樣品的性質如：極性、酸堿性、溶解度等氧化鋁一般適用于堿性和中性物質的分離硅膠微帶酸性適用于酸性和中性物質的分離13（三）展開劑的選擇劑14141、原則：要同時考慮固定相、流動相、被分離物質的性質。2、選擇合適的Rf值（據展開劑極性）3、選擇較好的選擇性（據溶的三角形分類）4、防止展開劑脫混易脫混：多元溶劑極性差別大，極性溶劑比例小5、多元溶劑系統展開劑不可重復使用圖示back（四）TLC的實驗操作1s制板固定相：硅膠(硅膠Hs硅膠Gs硅膠GF254)sAl2O3s素s聚酰胺s葡聚糖凝膠s硅藻土等載板：軟板(聚酯薄膜)s硬板(玻璃板)粘合劑：CMC-Na

0.3～1%，常用0.5%鋪板方法

傾注法s浸漬法s機械涂布（自動s手動）（圖示）s噴涂法TLP的干燥:先自然干燥，后烘干活化

自然干燥時要陰干，否則吸附劑外孔間大量溶劑急劇揮發，溢出薄層面破壞表面平整，或由于突然受熱引起薄層局部收縮龜裂。板的厚度分析用：0.3～1mm；制備用:1～2mm?back預制板18定性分析—窄條定量分析—10×20cm硅膠G：自含粘和劑硅膠H：不含粘和劑，鋪板時另加入CMC硅膠HF254：含熒光劑，254

nm紫外光照發綠光硅膠HF365：含熒光劑，18

365

nm紫外光照發光表11-3192、點樣（1）控制點樣量，防止拖尾1-10μL·

點樣量=樣品溶液濃度×點樣體積（2）控制斑點大小：一般在2～3mm193、展開（1）飽和展開飽和展開箱展開是指在展開前，箱內的各種氣液達到平衡（和），展開過程中，薄層上的溶劑不再蒸發，重現性好。（2）不飽和展開不飽和展開箱展開是指展開箱中氣體與溶劑蒸氣、薄層未達動態平衡時即開始展開；展開過程中，薄層上的溶劑不斷地薄層表面上蒸發，從而造成結果重現性差及邊緣效應邊緣效應：即同一種組分在同一塊板上，處于邊緣的點的Rf值大于中心點。

原因：a、邊緣處溶劑揮發快；b、多元溶劑時，易揮發溶劑在邊緣揮發快，從而難揮發溶劑（極性大）相對比例大洗脫能力強，使斑點移動快。（3）展開方式上行法、下行法、水平展開。（4）特殊展開技術連續展開（相當于增加展開距離）單向多級展開雙向展開分級展開（自動多步展開儀）2121·

4、檢出顯色、定位22有色物質直接定位。無色物質紫外光下定位（λ254，365）。熒光定位：發射熒光的物質在熒光背景下顯暗斑的物質（熒光熄滅）顯色定位（化學顯色）I2蒸氣（棕黃色）濃硫酸/MeOH（1:1）或10%H2SO4-乙醇溶液噴霧后，110℃烘烤22專屬顯色劑噴霧：人工、機械（五）定性分析1、比移值Rf、R（保留比）R’=

1 /（1+CsVs

/

CmVm）=1 /（1+KVs

/

Vm）Rst相對比移值圖12-8平面色譜展開示意圖比移值Rf、R影響因素24色譜條件一定，Rf只與組分性質有關，是薄層色譜基本定性參數，說明組分的色譜保留行為。k大，則移動慢，比移值小,Rf↓；正相薄層板，對于極性組分v

展開劑極性↑大，Rf↑大（容易洗脫）v

展開劑極性↓小，Rf↓小（不容易洗脫）Rf范圍：0<Rf

<1（組分遷移速度和距離小于展開劑遷移速度和距離）24Rf

=0.2～0.8（常用）；0.3～0.5（最佳）2、流動相的速率25與柱色譜相比，TLC、PC中，流動相的速率是不恒定的，展距越大，速率越小。3、固定相的變化平面色譜操作大多是敞開的，與大氣接觸，與柱色譜不同。在上樣時，吸附薄層會吸收空氣中的水或減活，從而造成結果不重現。25定性26Rf值定性影響Rf值的因素：飽合程度、濕度、溫度多種溶劑系統定性改變：a、極性b、酸堿性c、種類（組別）

d、正向、反相色譜26（六）定量27直接測定目測斑點面積薄層掃描TLCS間接測定（洗脫測定）分離后刮下相應的固定相，用溶劑將組分洗下，進行紫外測定27。（七）薄層掃描法（

TLCS）28薄層掃描法基本原理:樣品經薄層分離后直接測定或經適當處理使之顯色或產生熒光，在特定波長下，用光度計測其吸光度或熒光強度的方法稱為薄層掃描法。薄層掃描儀測定方法：吸收測定法（UV-Vis）、熒光測定法281、吸收測定法29利用可見光或紫外光照射展開后的薄層，測定色譜斑點的吸光度A隨展開距離L的變化，得到A-L或A-Rf

曲線，即薄層掃描圖。色譜峰面積，可用于定量分析。由于薄層板存在明顯的散射和反射現象，所以斑點中組分濃度與A的關系不服從Beer定律，需要Kubelka-munk理論來描述。理想空白薄層板的單位薄層厚度的吸光系數K=0，實際上，K≠0，為消除此影響，以空白板為基準，測定空白透光率或反射率來計算2斑9

點的吸光度。·

透射法透光率：A=-lgT/T0空白板和斑點·

反射法（常用）空白板和斑點T0=i0/I0

；

T=i/I0反30射率：A=-lgR/R0R0=j0/I0；R=j/I0302、熒光測定法31熒光：某些物質吸收特定波長的光后，除產生吸收光譜外，還會發射比原來吸收波長更長的光。靈敏度高，但適用范圍窄，要求組分發射熒光（衍生）F=ФI0

abcI0：入射光強度

b：薄層厚度Ф：熒光效率a：吸光系數31c：樣品濃度323、掃描方式32直線形掃描：光束以直線軌跡通過色斑，光束應將整個色斑包括在內。適用于外形規則的斑點。鋸齒形掃描：光束呈鋸齒狀軌跡移動。適用于外形不規則及大的色斑。4、定量方法外標法外標一點法外標兩點法2）內標法33331、高效薄層色譜（HPTLC）固定相粒度：5～10μm分離度高、靈敏度高、展開時間短經典薄層板與高效薄層板的比較經典薄層高效薄層點樣體積1～5μl100～500nl溶液濃度0.01～1.00%原點直徑5mm(3mm3m4)1～2mm起始線距底邊距離1.5cm1cm展距10～15cm5～7cm點與點間距1～2cm0.5cm固定相顆粒直徑10～40μ3m4(20μm)5～10μm(7μm)（八）特殊薄層色譜法2、膠束薄層色譜

當表面活性劑水溶液超過一定濃度（臨界膠束濃度CMC）時，多余的表面活性劑不再溶解，而聚集成膠束，成為膠體分散體系；由于被分離物質在水、膠束、固定相三者之間相互作用（分配系數、靜電作用、空間效應等）而具有很好的選擇性。

作為流動相的表面活性劑，具有疏水基和親水基團，在水溶液中，其分子可聚集在一起，形成親水基向外、疏水基向內（或相反）的締合體，即膠束。膠束的存在能使不溶或微溶于水的有機化合物的溶解度增加

流動相用低濃度表面活性劑的水溶液或含有少量水的非極性有機溶液固定相：多用聚酰胺板或薄膜；其次為氧化鋁，硅膠板較少應用表面活性劑：陰離子：十二烷基硫酸鈉（SDS）

陽離子：十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十六烷基三甲基氯化銨（CTAC）兩性：十八烷基二甲基甜菜堿；十二烷基氨基丙酸鈉以濾紙做載體，以構成濾紙的纖維素所結合水分為固定液，以有機溶劑為展開劑的色譜分析方法。固定相：紙纖維吸附的水流動相：有機溶劑（乙醇、丙醇、丙酮）或水討論：Rf

與組分性質、流動相及溶解度有關：36極性組分→易保留，Rf小（流動相極性↑，Rf

）36非極性組分→易流出，Rf大（流動相極性↑，Rf