益生乳桿菌質粒形成的耐藥性及耐藥基因分析

廣泛應用于食品、藥物、乳液、飼料等行業，并與人們的日常生活密切相關。FAO/WHO在《用于食品的益生菌安全性評價指導原則》中指出,未經評估的益生菌可能會存在一些潛在的安全性問題,其中,長期使用的益生菌所攜帶耐藥基因的轉移是人們所擔憂的。目前,抗生素濫用已成為一個嚴重的社會問題,由此引發的細菌耐藥性問題也日趨嚴峻。盡管傳統的益生菌菌種已有很長的安全使用歷史,如德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgricus),然而伴隨著新菌種的不斷開發和進入市場,其潛在的安全性問題也逐漸引起人們的重視。近十年來,有關乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌的耐藥性方面已經開展了一定的研究工作。研究發現,大部分乳酸菌對抗革蘭陰性菌的抗菌藥具有耐藥性,例如鏈霉素、慶大霉素和卡那霉素,其中部分乳桿菌對萬古霉素、卡那霉素、多黏菌素B等表現出抗藥性。D’aimmo等報道了雙歧桿菌、乳桿菌、片球菌等對卡那霉素、萘啶酮酸、多粘菌素B等的抗性以及與抗性有關的基因,如長雙歧(Bifidobacteriumlongum)抗四環素的基因tet(W),干酪乳桿菌(L.casei)抗四環素和紅霉素的質粒基因tet(M)和erm(B)等。Toomey等和ANA等則進一步報道了抗四環素基因tet(M)在菌株間的轉移現象。顯然,這種抗藥基因在菌種間的轉移會對人類的健康產生影響。食品是益生菌的主要載體,益生菌的安全性勢必影響到其食品的安全,因此其耐藥性以及抗生素抗性是否可轉移就會引起人們的重視。本研究對前期篩選到的幾株能夠耐受胃酸、膽鹽和蛋白酶的乳桿菌的耐藥性進行了研究,通過質粒消除探討了耐藥性與質粒的相關性,對進一步確定耐藥性的轉移提供了理論基礎,旨在為潛在益生乳桿菌的安全性評價及其評價方法的建立提供理論和技術參考。1材料和方法1.1質粒、試劑與儀器5株耐受胃酸、膽鹽和蛋白酶且含有質粒的乳桿菌其菌種編號、名稱及來源見表1,該菌種均由中國工業微生物菌種保藏中心(CICC)收藏;抗生素敏感性實驗的質控菌株采用CLSI(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,臨床實驗室標準化研究所,簡稱CLSI,以前稱NCCLS)推薦的大腸桿菌ATCC25922,購自中國科學院微生物研究所;乳桿菌采用MRS培養基,37℃培養;大腸桿菌ATCC25922采用LB培養基,30℃培養;氨芐西林10μg/片、桿菌肽0.04U/片、青霉素G10U/片、多粘菌素B300μg/片、利福平5μg/片、頭孢噻吩30μg/片、鏈霉素10μg/片、卡那霉素30μg/片、四環素30μg/片、氯霉素30μg/片、慶大霉素10μg/片、萘啶酸30μg/片、萬古霉素30μg/片(直徑6mm)均購自中國藥品生物制品檢定所,符合CLSI標準;SDS、EB、氯霉素、氨芐青霉素美國Sigma公司;質粒提取試劑盒、PCRMix、100bpLadderMarker北京天根試劑公司;λHindⅢMarker、HB101上海寶生物公司;溶菌酶Biotech公司。GL-20G-II型冷凍離心機、TGL-16G型臺式離心機上海安亭科學儀器廠;XSZ-G型光電顯微鏡重慶光學儀器廠;SPX-150B型生化培養箱上海博訊實業有限公司;BTS-20M型凝膠成像系統、TGradientThermocycler96型PCR儀德國Biometra公司。1.2實驗方法1.2.1抗菌藥物敏感性檢測參考管遠志等的方法。待測菌在MRS培養基(蛋白胨10.0g/L,牛肉膏10.0g/L,酵母膏5.0g/L,檸檬酸氫二銨2.0g/L,葡萄糖20.0g/L,吐溫801.0mL/L,乙酸鈉5.0g/L,磷酸氫二鉀2.0g/L,硫酸鎂0.58g/L,硫酸錳0.25g/L,pH6.2±0.2)中,37℃培養16h后,以無菌生理鹽水稀釋至0.5麥氏標準濁度(菌體濃度約為5×108CFU/mL)。取該菌液1mL入滅菌平皿中,將融化的MH固體培養基(牛肉膏6.25g/L;酪蛋白胨17.5g/L;可溶性淀粉1.5g/L;瓊脂1.3%;pH7.2±0.2,)約20mL倒入平皿,混勻。待培養基凝固后,室溫放置3~5min,用鑷子將藥敏紙片貼放在平皿上,輕壓使緊貼瓊脂表面,靜置5min,置于37℃培養箱內,恒溫培養16~18h。量取抑菌圈直徑,并記錄結果。以標準敏感菌株大腸桿菌ATCC25922為質控菌,操作同上。受試菌株對多種抗生素的敏感性參照國際現行的臨床實驗室標準化協會CLSI制定的《抗菌藥物敏感性實驗執行標準》第十九版信息增刊提供的紙片法標準進行判定(見表2)。報告該受試菌對該抗生素是敏感(susceptible,S)、耐藥(resistant,R)、還是中介(intermediate,I)。1.2.2溶菌酶trshcl法取培養過夜的菌液10mL于離心管中,10000r/min離心5min,棄去上清,向沉淀中加入10mg/mL溶菌酶(以pH8.0,10mmol/L的TrisHCl配制)500μL,搖勻,37℃水浴45min。采用質粒提取試劑盒,對待測菌株質粒進行提取,并進行1%的瓊脂糖凝膠電泳,以λHindⅢ為標準分子量Marker。1.2.3絕粒精華1.2.3.1.sds法1.2.3.質粒提取與用藥實驗將待測菌株以2%的接種量接至含有不同濃度SDS的滅菌MRS培養基中(SDS濃度分別為0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%),37℃恒溫培養24h,再以2%的接種量轉入滅菌MRS培養基中,42℃恒溫培養24h,此為一個循環,重復2~3次,以質粒消除前菌株為對照,分別進行質粒提取,并對消除后的菌株進行抗生素敏感性檢測。1.2.4菌株全序列的合成在NCBI中查到質粒上的β-內酰胺類抗性基因blr、ECP-1569、nps-1,以及氯霉素抗性基因cmlA、cat、cmlA1,在Genbank中下載其全序列,設計引物,序列見表3,委托三博遠志公司合成。以待測菌株的質粒DNA為模板,進行PCR反應。反應程序為:94℃預變性4min,94℃變性30s,相應溫度退火30s,72℃延伸1min,34次循環,72℃延伸10min。反應產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳(80~120V,30min),觀察產物電泳帶及其位置,按照100bpLadderMarker確定擴增產物的大小。委托寶生物工程(大連)有限公司對PCR產物進行回收、測序。2結果與分析2.1抗菌藥物敏感性檢測采用K-B藥敏紙片法檢測5株乳桿菌對13種抗生素的敏感性,記錄抗生素對供試菌株的抑菌圈直徑,結果見表4。按照CLSI制定的《抗菌藥物敏感性實驗執行標準》提供的紙片法標準進行判定,結果如表5所示。據表5可知,待測的5株乳桿菌對萬古霉素、多粘菌素B、桿菌肽、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素以及萘啶酸具有普遍的抗性,耐藥率達100%,而主要對四環素敏感,其中,嗜酸乳桿菌LL對11種抗生素(除青霉素G、利福平外)表現出較普遍的抗性。2.2菌種質粒dna條帶和耐藥基因檢測采用質粒提取試劑盒對待測乳桿菌的質粒進行提取,結果如圖1所示。注:1.CH8;2.LL;3.Lp-A;4.L11;5.LLB;M:λHindⅢMarker。由圖1可見,戊糖乳桿菌CH8的電泳圖顯示有6條質粒DNA條帶,其中一條大于23kb。戊糖乳桿菌Lp-A顯示有兩條質粒DNA條帶,分別為10kb、5kb左右。嗜酸乳桿菌LL和植物乳桿菌L11分別顯示有2條和4條質粒DNA條帶,均含有一條10kb左右的質粒條帶。瑞士乳桿菌LLB的電泳圖僅顯示一條10kb左右的質粒DNA條帶。乳酸菌中普遍存在著質粒,至少25種乳桿菌具有固有質粒,而且一種菌有多個質粒,質粒大小一般在1.9~84.8kb,絕大多數的質粒小于20kb。Gevers等(2003)對風干香腸中的乳桿菌進行檢測,發現這些乳桿菌均具有10kb左右的質粒,且在這些質粒上攜帶了四環素耐藥基因tetM。在細菌的傳代過程中,某些質粒可能會從細胞中消失,但大多數的質粒是穩定存在的。本研究也對傳代30代后上述乳桿菌菌株的質粒進行了檢測,結果證明了其質粒的穩定性。2.3質粒消除方法耐藥質粒的存在是細菌耐藥性的一個主要原因,因此質粒消除是耐藥性消除的一種重要方法。質粒消除便于觀察比較消除前后菌體表型的變化,從而得出質粒的遺傳功能,在對于質粒所含基因的研究中具有重要意義。2.3.1sds法以去除沉積物2.3.1.sds濃度對植物乳桿菌質粒的影響采用濃度為0.05%~0.25%的SDS分別處理供試菌株,在SDS濃度為0.15%、0.2%和0.25%時,上述菌株均不能存活;濃度為0.1%時戊糖乳桿菌Lp-A和植物乳桿菌L11不能存活。因此選擇SDS處理后存活的菌株進行質粒檢測,結果如圖2~圖6所示。結果表明,SDS濃度為0.05%時,植物乳桿菌L11的四條質粒(在1~10kb不等)被完全消除(見圖4,泳道2),戊糖乳桿菌CH8的質粒沒有被消除。當SDS濃度增加到0.1%時,戊糖乳桿菌CH8的6條質粒丟失了5條,包括一條大于23kb的質粒及2kb到10kb間大小不等的4條質粒,一條15kb左右的質粒沒有被消除(見圖2,泳道3)。而嗜酸乳桿菌LL(見圖3)、戊糖乳桿菌Lp-A(見圖6)和瑞士乳桿菌LLB(見圖5)的質粒均未被消除。由此可見,用SDS消除乳桿菌質粒的效果不顯著,與之前的相關報道不相符。2.3.1.質粒消除前后ch8菌株的抗菌藥活性檢測采用K-B藥敏紙片法檢測質粒消除后的CH8和L11菌株對抗生素的敏感性,結果見表6。由表6可知,戊糖乳桿菌CH8質粒消除前后,其抗生素敏感性發生了部分變化。質粒消除前,CH8菌株對氯霉素和頭孢噻吩均表現出抗性,而消除后對這兩種抗生素均表現出敏感,對其他11種抗生素的敏感性沒有變化。可見,消除的質粒上可能含有抗氯霉素和頭孢噻吩的抗性基因。而植物乳桿菌L11消除了全部質粒后,與消除前相比,其抗生素敏感性沒有變化,這也初步表明,植物乳桿菌L11的質粒上不含有所試抗生素的抗性基因,或者在質粒和基因組上同時含有所試抗生素的抗性基因。2.3.2sds-高溫法可以去除沉積物2.3.2.sds-高溫對ch8部分菌株質粒的影響采用濃度0.01%~0.03%的SDS分別處理供試菌株,并進行高溫培養。在SDS濃度為0.01%、0.015%和0.02%時,上述乳桿菌均存活,但只有CH8的質粒被部分消除,且消除效果并不隨濃度的增加而改變,濃度為0.025%、0.03%時,CH8和部分菌株不能存活,仍具有存活能力的菌株,其消除效果不隨SDS濃度的增加而改善。因此選擇SDS-高溫處理后存活菌株進行質粒檢測,結果如圖7~圖11所示。結果表明,嗜酸乳桿菌LL(見圖8)、戊糖乳桿菌Lp-A(見圖9)、瑞士乳桿菌LLB(見圖10)和植物乳桿菌L11(見圖11)在SDS-高溫處理后質粒并沒有被消除,而戊糖乳桿菌CH8的6條質粒中丟失了5條(見圖7,泳道1、2、3),被部分消除。注:M:Marker,1:對照,2:0.01%SDS,3:0.015%SDS,4:0.02%SDS。2.3.2.2.去除顆粒后對植物和抗生素的敏感性改變2.4戊糖乳桿菌的質粒與菌株的基因型定位以戊糖乳桿菌CH8的質粒為模板,以表3中相應的序列為引物,進行PCR反應,結果如圖12所示。由圖12可見,戊糖乳桿菌CH8的質粒上存在β-內酰胺類抗性基因blr,不含有其他抗性基因。對上述目的條帶進行回收、測序,并經DNAmanaligment分析發現,該序列與目的序列僅在第43和64位點有兩個堿基的差異,很可能是由于菌株差異造成的。因此可以初步確定戊糖乳桿菌CH8的質粒上含有blr基因,且該基因是決定其頭孢噻吩抗性的基因。將該戊糖乳桿菌CH8菌株的質粒轉化大腸桿菌也進一步證實了這一點。然而,要確定blr基因位于CH8菌株的哪些質粒上還有待于進一步研究。國內外常用的藥敏檢測方法都是通過細菌的表型來判斷其耐藥性,且對于抗性基因的研究多集中于致病菌。如果能在菌株抗生素抗性的表型與基因型之間建立聯系,就可能對該表型對應的基因進行定位,從而從分子水平對細菌的耐藥性進行深入分析。目前,我國還少見由益生菌感染動物及人體的報道,也缺乏對其耐藥性及使用后的流行病學調查資料,對益生菌的安全性評價手段與國際水平還處在一定的差距。隨著越來越多的新菌種申報進入國內市場以,也附帶了不安全性的風險。因此,本研究方法可以為乳制品市場常用益生菌菌種的安全性進行風險評估,為建立適合國情的益生菌安全性評價體系提供技術依據。3質粒消除前后戊糖乳桿菌的耐藥性分析3.1以大腸桿菌ATCC25922為質控菌株,對5株潛在益生乳桿菌的抗生素敏感性研究表明,菌株均對萬古霉素、多粘菌素B、桿菌肽、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素以及萘啶酸表現出普遍的抗性,耐藥率達100%。3.2無論采用SDS還是SDS-高溫法消除質粒方法,僅對部分菌株中的某些質粒有效,即不同菌株之間,對于不同的質粒其消除方法的有效性存在著差異。3.3對消除質粒后的戊糖乳桿菌CH8抗生素敏感性的分析表明,CH8菌株的質粒上存在決定其頭孢噻吩抗性的基因blr,這在一定程度上反映出益生乳桿菌質粒抗生素抗性基因與其耐藥性間存在相關性。將待測菌株以2%的