乳酸桿菌的分離篩選及其代謝產物協同抑菌作用的研究

20世紀40年代以后，由于抗生素在畜牧業中的廣泛應用和顯著影響，人們對益生素的含義和應用沒有給予充分關注。近年來,英國的瘋牛病、比利時的二惡英事件和香港的瘦肉精中毒事件使消費者對動物產品的安全問題日漸關注,抗生素在飼料中添加可能引起的耐藥性、殘留和“三致”作用使益生素又重新得到了研究者和生產者的重視。益生素的再度興起主要是由于人們對動物食品安全的要求提高。1908年IijaMetchnikoff發現保加利亞牧民長壽的原因是他們有食用酸奶的習慣,他認為酸奶中的乳酸桿菌能預防和治療多種疾病。隨后在20世紀前半葉,嗜酸乳酸桿菌廣泛地應用于食品行業。自然界存在的乳酸桿菌至今未發現有致病作用的菌株,美國FDA和AAFCO在1989年公布的安全微生物品種共43種,其中乳酸桿菌占12種,中華人民共和國農業部1999年公布允許使用的12種飼用微生物中有3種是乳酸桿菌。在美國,益生素工業上應用的產品57%含有乳酸桿菌屬。何明清,等(1986)對病、健仔豬腸道菌群的研究發現,腹瀉仔豬腸道中的乳酸桿菌數量顯著下降,大腸桿菌數顯著上升。使用乳酸桿菌益生素可以調整胃腸道微生態平衡,所以乳酸桿菌類益生素將是很有前途的防治仔豬腹瀉的制劑。仔豬在生長早期容易患大腸桿菌性疾病,根據報道致病性大腸桿菌的主要血清型是K88、K99和987P,因此應用體外法測定乳酸桿菌抑制大腸桿菌的能力是評價乳酸桿菌益生作用的一項很有價值的指標。本試驗通過測定乳酸桿菌的乳酸產量、采用平皿挖溝法測定其代謝產物對不同血清型大腸桿菌的抑制能力及用濃度梯度法測定乳酸桿菌菌體和代謝產物對大腸桿菌的協同抑制作用。1材料和方法1.1ph、n、n-fmo乳酸桿菌培養基:MRS肉湯培養基(蛋白胨,10g;牛肉浸膏,10g;酵母浸粉,5g;磷酸氫二鉀,2g;枸椽酸二銨,2g;葡萄糖,20g;七水硫酸鎂,0.58g;蒸餾水,1000ml;用1mol/LNaOH調pH到7.0)。3種血清型的大腸桿菌(K88、K99和987P)均購自中國獸藥監察所。乳酸桿菌:3株分離自21日齡斷奶后健康仔豬的胃粘膜上皮。大腸桿菌培養基:營養肉湯(購自上海市醫學化驗所試劑廠)。檢測大腸桿菌的培養基;麥康凱(MacConkay)培養基(購自北京天壇生物制品股份有限公司)。大腸桿菌在麥康凱瓊脂上長成紅色菌落。1.2菌種距離檢測乳酸桿菌培養液:每個亨蓋氏(Hungates)管里加MRS肉湯約15ml,然后充二氧化碳,用0.1%新配的刃天青溶液作氧指示劑,無氧時刃天青呈無色。加蓋后在高壓蒸汽滅菌鍋里經121℃保持15分鐘,制成無菌厭氧MRS肉湯。待涼下來后接種從健康仔豬胃里分離的3株乳酸桿菌,接種量為1%(約107CFU/ml),在37℃培養箱里培養24小時后,置4℃冰箱保存備用。乳酸的測定:取2ml乳酸桿菌培養液,15000r/min離心15分鐘,取上清液,用超純水稀釋后在TehniconRH100生化分析儀上測定。抑制大腸桿菌試驗:A:制作麥康凱培養基,無菌操作傾倒平皿,每個平皿的培養基厚度約為6mm。用記號筆在平皿底部劃線將平皿分成三個平行的區域,每個區域用接種棒劃線接種大腸桿菌培養液(4.0×108CFU/ml)于培養基表面,然后在距平皿中線約4cm的地方挖一寬為1cm的溝,與劃線的培養物垂直,如圖1所示。分別用3株不同的乳酸桿菌培養物將溝填滿(不能溢出),置普通培養箱37℃培養18小時后,觀察測定離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝的距離。B:根據A試驗的結果,選擇其中一株乳酸桿菌,取5ml該乳酸桿菌培養物(8.2×109CFU/ml)分別與5、10、15ml營養肉湯混合,制成3個含不同乳酸桿菌培養物濃度的營養肉湯,接種大腸桿菌,接種量為培養液的5%,置37℃,5%CO2培養箱培養4、8和18個小時后,分別用無菌注射器取出培養液,培養液經梯度稀釋成10-2~10-5后,每個稀釋度作4個平行樣,取0.3ml稀釋液,用接種棒均勻涂布于麥康凱瓊脂平板上,置37℃,普通培養箱培養18個小時,取菌落數在50~150個的平皿計數,取平均值,計算每毫升培養液中大腸桿菌的數量。2結果與討論2.1表1顯示了24小時后對乳酸桿菌菌進行栽培的牛奶量乳酸是乳酸桿菌的代謝產物之一,據報道乳酸是乳酸桿菌代謝產物中對大腸桿菌起抑制作用的主要成分。2.2離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝的距離平皿挖溝法抑菌試驗的原理與平皿挖孔法相似,是由于放置于溝中的抗菌物質能滲透過瓊脂來達到對大腸桿菌的抑制作用,隨著離溝距離的增大,能滲透過去的抗菌物質的濃度就越小。所以乳酸桿菌代謝產物抑制大腸桿菌的效果以離小溝最近的大腸桿菌菌落與小溝的距離為指標,距離越大,說明其代謝產物所含抗菌物質的抑菌效果越好,結果見表2。從表2可以看出,本試驗所用3株乳酸桿菌的代謝產物對大腸桿菌K88和K99都有很強的抑制作用,而對987P的抑制作用較弱,乳酸桿菌3甚至對987P沒有抑制作用。結果表明,乳酸桿菌的代謝產物對不同血清型大腸桿菌的抑制作用有一定的差別。結合表1和2的結果可以認為,乳酸產量相近的乳酸桿菌對同一血清型大腸桿菌的抑制作用存在差異,可以推斷,乳酸桿菌的代謝產物中對大腸桿菌起抑制作用的成分不止乳酸一種,但乳酸可降低培養基pH值,這可能會增強乳酸桿菌分泌的其它成分如細菌素、過氧化氫等對大腸桿菌的抑制作用。2.3乳酸桿菌對不同血清型大腸桿菌的抑制作用從表3可以看出,乳酸桿菌培養物占肉湯50%時,經過4小時培養后,大腸桿菌數量下降了40~60倍,再經過4小時的培養,大腸桿菌的數量下降得更快,K88下降近4000倍,K99下降近2000倍,987P下降近100倍,共培養18個小時之后,在培養液里已檢測不出大腸桿菌,說明大腸桿菌已全部被殺死。不同血清型的大腸桿菌在含1/2乳酸桿菌培養物的營養肉湯中數量下降速度不同,說明在含50%乳酸桿菌培養液的肉湯中,乳酸桿菌對不同血清型大腸桿菌具有不同的抑制作用。乳酸桿菌培養物含量為1/3和1/4的肉湯中,經過4小時培養后,大腸桿菌數量分別下降了25倍和15倍左右,再經過4小時的培養,大腸桿菌的數量下降得更快,三種大腸桿菌都下降近1000倍,共培養18個小時之后,在培養液里已沒有大腸桿菌,說明大腸桿菌已全部被殺死。不同血清型的大腸桿菌在同樣濃度的乳酸桿菌培養物中數量下降速度基本相同,說明在含1/3和1/4乳酸桿菌培養液的營養肉湯中,乳酸桿菌對不同血清型大腸桿菌的抑制作用基本相同,抑菌作用比含50%的乳酸桿菌培養液的營養肉湯時較弱,但18小時之后的抑菌效果是一樣的。隨著培養時間的延長,大腸桿菌數量下降的速度加快,可能是在培養初期乳酸桿菌的主要作用是抑制大腸桿菌,而在后期則主要是殺菌作用。隨著培養時間的延長,乳酸桿菌的生長及其代謝產物的積累提高了其殺