免疫組織化學考題2023級考題簡述原位雜交組織化學的根本原理。P84簡述免疫組化染色ABC法的根本原理。P52組織塊進展固定的原理是什么?常用的固定方法和固定劑有哪些?P10何為細胞培育術?舉例說明其在生物學醫學爭論中的應用.細胞凋亡的形態學檢測方法有哪些?何為色溫?在顯微攝影中常用日光型膠片在燈光下拍照,您將用何種方法調整色溫?P184何為像素？在數碼攝影中常考慮的參數是什么？P136;P198酶標抗體免疫細胞化學間接法的根本原理是什么？此法的優缺點是什么？按此方法選擇抗體時應留意什么問題？P51結合本專業的爭論方向，自行設計一個雙重免疫熒光細胞化學染色的試驗，并寫出試驗流程，簡述免疫熒光細胞化學染色中的留意事項。學過此門課程后有何感想？為使此課程開設的更好，請留下您貴重的意見和建議。2023級考題簡述形態學爭論有哪些主要常用技術？這些技術能解決哪些問題？試述石蠟切片和HE染色的根本制備過程，并指出制備免疫組化的石蠟切片和用于HE染色的石蠟切片有何不同。P11;P207;P208上課留的作業何謂免疫熒光染色，用何種方法消退非特異熒光？P44;P74ANNVASSAY檢測細胞凋亡的原理、試驗流程和結果分析。現的一種。在凋亡細胞中，細胞膜磷脂酰絲氨酸〔PS〕從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的外Annexin-V35-36KDPS具有較高的親和力。細胞凋亡時，可以和外翻的PS結合，從而可以檢測凋亡的細胞。發生死亡的細胞其細胞膜上的PS也外翻，因而也會陽性。因此，還會加一種DNA染料，常用的有P1。由于死亡的細胞膜通透性增高，染料可以進入細胞內和DNA結合，從而可以發熒光，區分出死細胞。試驗流程：1〕細胞收集：懸浮細胞直接收集10ml的離心管中，而貼壁細胞先用滴管輕輕10ml0.02%的EDTA消化使之脫壁，每樣本細胞數為〔1-5〕×106，500~1000r/min5min棄去培育液。2〕1次，500~1000r/min5min。3〕100μl的標記溶液重懸細胞，室溫10~15min。4〕500~1000r/min5min1次。5〕參與熒光溶液4℃下孵育20min，避光并不時振動，上機檢測。6〕流式細胞儀分析：流式細胞儀激發光波長用488n515nm透帶濾器檢測FTTC560nmP1。結果分析：凋亡細胞對全部用于細胞活性鑒定的染料如P1有抗染性，壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被P1著染產生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產生。因此，在細胞凋亡的早期P1不會著染而沒有紅色熒光信號，正常活細胞與此相像。何謂像素？簡述數碼相機攝影的根本原理。P198影響曝光的因素有哪些？什么狀況下使用光圈優先？什么狀況下使用快門優先？什么狀況下考慮膠片的感光度或相當感光度？P180談談你學習這門課的感想和體會？并提出對這門課的建議。作業：設計一個自己爭論領域的小試驗〔方法要有免疫組化技術〕要求：1.要解決的問題技術必需有免疫組化技術預試驗結果簡述廣義的組織化學均包含那些主要承受技術？這些技術能解決科研中的哪些問題？蛋白質，多肽氨基酸多糖磷脂受體酶急速核酸記病原體都課用相應的特異性抗體進展檢測，因此成為生物醫學各學科領域的重要爭論手段。電鏡組織化學主要用于檢測一些酶的活性及其在超微構造的定位雖然目前酶的種類超2200100捕獲反映〔金屬鹽城點發嗜鋨性物質生成法。免疫電鏡是依據抗原與抗體特異性結合的原理產生高電子產物的標記抗體在超微構造水平對抗體進展定性定位。原位雜交是將分子雜交技術與組織化學相結合而在核酸原有的位置上進展細胞內核酸定性定位的一種技術。更多用于定位細胞內mrna它可為爭論單一細胞中編碼各種蛋白質和多肽〔前體的相應MRNA定位以及爭論細胞內基因表達有關因素的調控供給有效地手段另外像遺傳學病毒學神經內分泌學病理學免疫學及發育生物學等個領域試述石蠟切片和HE染色根本制備過程？并指出制備免疫組織石蠟切片和HE染色的石蠟切片有何不同？石蠟切片根本制備：取材，固定，脫水，透亮，透蠟，包埋，切片，貼片，染色，透亮，封藏。損傷所需部位并隨即投入固定液。切取材料時刀要銳利，避開因擠壓細胞使其受到損傷。切取的材料應當小而薄，便于固定劑快速滲入內部。一般厚度不超過2mm，大小不超過5×5mm2。固定：常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸。其中，苦味酸、升汞、鉻酸既能凝固細胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、餓酸和重鉻酸鉀對這兩種蛋白質都不凝固。混合固定劑有：Bouin液〔70份苦味酸飽和水溶液+254％甲醛+5份冰醋酸、Zenker液〔5g2.5g1.0g＋5ml冰醋酸＋100ml蒸鎦水、Carnoy改進液〔3份無水乙醇+1份冰醋酸〕等。固定劑的種類甚多，我們必需依據各種固定劑的性能及制片的不同要求來加以選擇。固定時，須留意以下幾點：固定劑應有足夠的量，一般為組織塊體積的10～15倍。如所固定的材料外表有不易穿透的物質，可將材料先在含乙醇的溶液中固定幾分鐘，再移入水溶性的固定液。材料固定后如不馬上下沉，可將其中氣泡抽出。固定時間依材料大小、固定劑種類而異，可從1小時到幾十小時，有時中間需要更固定劑。某些固定劑對組織的硬化作用較強，作用時間應嚴加把握，不能過長。一般固定劑都以配制的為好，用過的不能再用。有些混合固定劑由甲、乙兩液合并者，確定要在使用前才混合。固定完畢，依據所用固定劑的不同，用水或乙醇沖掉殘留的固定劑，以免固定劑形成沉淀，影響以后組織塊的染色。脫水生物組織中含有大量的水分因此須使用脫水劑將水分除盡，這就是脫水的作用。透蠟。3050％、70％、80％、95％、100％至完全脫水；對于一些松軟的組織應從15％開頭。脫水時間依據45min1h，假設中間須停頓，應使材料停留在70％乙醇中，由于低濃度乙醇易使組織變軟、解體，高濃度乙醇有脆化組織作用，放濃度降低而使脫水不徹底。需要保存的材料可脫水至70%乙醇時停留其中，如需長期保存，可參與等量的甘油。丙酮也是很好的脫水劑，其作用和用法與乙醇一樣，不過其脫水力和收縮力都比乙醇強。甘油常用于藻類、菌類及柔弱材料的脫水。留神。正丁醇可與水及乙醇混合，亦為石蠟溶劑，其優點是很少引起組織塊的收縮與變脆。叔丁醇的性質、作用和用法同于正丁醇，但因其價格昂貴而很少使用。透亮水劑后，石蠟便能順當地滲入組織。透亮劑的種類很多，較常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。積混合液，再進入純二甲苯，這樣可削減上述的缺點。透亮時間應由組織大小而定，—般各30min2h，在純二甲苯中應更換2次，總時間則以不超過3h為宜。材料經白色云霧狀，說明脫水不凈，須返工處理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透亮時，應20甲苯的一般性質與二甲苯相像。用法亦同，唯沸點較低，透亮較慢，但不會使組織變脆。大塊組織的透亮。透蠟和包埋包埋用的石蠟，熔點在50～60℃之間，應依據材料本身的硬度、切片的厚薄和當時的氣溫條件來選用。一般動物材料最常用的石蠟熔點為52～56℃，植物材料的用54～58℃的；切52～54℃的石蠟可46～4856～58℃的。結且無氣泡和裂痕，30～3524h后再用，方法是將石蠟放入鍋內，加熱到開頭冒白煙，然后用小火連續加熱30min〔留意別超過發火點，使其去除水分和揮發性雜質，并在溫箱中過濾以去除灰塵等顆粒。3用石蠟與二甲苯的等量混合液、純石蠟處理。純石蠟應處理2～3次，透蠟的時間依材料性15～30min。織收縮發脆。包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟中。具體做法是；先預備好紙盒〔1-3及說明，將熔蠟倒入盒內，快速用預溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部，切面朝下，再輕輕提起紙盒，平放在冷水中，待外表石蠟凝固后馬上將紙盒按入水中，使其快速冷卻凝固，30min后取出。也很重要，否則包埋塊中將會產生結晶。以后切片時引起碎裂。切片石蠟塊的固著與整修在包埋以后，就可進展切片。包埋好的石蠟塊裝上切片機進展切片前還須進展固著和整修。用加熱的蠟鏟將包埋塊粘貼于固著物上，并使組織塊朝外，便于以后快速切出所需的片子。四周附著寬2～3mm的石蠟，而修好的蠟塊呈長方形。還可削去一角以便于在蠟帶上識別切片。切片機和切片刀一張符合厚度要求的切片。切片刀與切片的質量直接相關。切片前必需磨刀，方法是：將切片刀裝上刀柄、刀背夾、滴甲苯將石蠟油擦凈。切片方法至外緣后松開刀片夾的螺旋，上好刀片，使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角，個刻度之間，否則簡潔損傷切片機，將刀臺移至近標本臺處，讓刀口與組織切面稍稍接觸，應準時用氯仿將切片機的有關局部擦凈。貼片后才能貼附，否則影響染色和觀看。貼片一般有撈片法和燙板法。撈片法比較簡潔，首先將切片分割開，投入到48℃的溫水浴中，這時切片都浮在水面上，由于外表張力的作用使切片自然展平，然后用涂有甘油蛋白溶液〔將雞蛋一個打破入杯中，量的甘油，混合，最終參與百分之一體積的麝香草酚〔thymol〕作防腐用，可保存幾個月到〕或5％明膠水溶液的載玻片傾斜著插入水面去撈取切片，使切片貼附在載玻片的適宜位置，于室溫下放置一晝夜后使其徹底枯燥。35℃恒定的燙板上讓切片攤干，并傾斜或用吸水紙吸去水分，最終將載玻片再度放燙板上晾干。要留意，不管是使用撈片法還是燙板法，所用的載玻片必需干凈，不能有油污〔檢驗法：已清潔，有殘留油脂等物在上面；切片的光面應朝下，否則染色過程中切片簡潔脫落。染色石蠟切片蘇木素一伊紅染色法的根本步驟：〔〕二甲苯I----15分鐘〕二甲苯II----10分鐘3〕無水酒精I 2分鐘，4〕無水酒精II----2595%酒精----2分鐘〔〕80%----2分鐘，〔7〕自來水洗片刻8〕蒸餾水片刻〔〕蘇木素液染核 5分鐘〔1〕自來水洗片刻11鹽酸酒精分----0.5分鐘12〕流水沖洗片刻〔1〕弱氨水水溶液反----1〔1〕----15分鐘〔1〕復染．5％伊紅水溶液〔比照染色----7分鐘〔1〕自來水洗〔分化伊紅〕片刻〔195％酒精I 2分鐘〔1〕95酒精II----2分鐘〔I〕無水酒精I----2分鐘〔2〕無水酒精II----2分鐘，二甲苯I 5分鐘〔2〕二甲苯II5〔2〕蓋玻片下封固。免疫組化的石蠟切塊所需的石蠟必需是滴熔點的石蠟防止破壞組織的抗原性是用一抗與被檢測組織中目的蛋白抗原結合，然后HRP等標記的二抗與一抗進展結合，最終通過DAB顯色反響，進而確認所要檢測蛋白抗原的定位、半定量等目的。2、HE染色是用蘇木素和伊紅分別染上胞核和胞漿，可以區分出一般細胞的形態，在實際診斷惡性腫瘤和腫瘤的很好的方法。3HEHE染色比較粗略地識別不同細胞形態學轉變；而后者能夠針對特異性細胞標志物來檢測特異性細胞的轉變〔數量、也可檢測細胞內細胞因子的轉位〔如active-caspase3cleaved-caspase3的胞核和胞漿分布狀態、組織中一〔。3.何謂免疫熒光染色常用的免疫熒光素有哪些？請列出兩種能與DNA結合的熒光素？三種與蛋白質結合的熒光素，并分別說明他們的吸取波長和放射波長以及熒光顏色？熒光是指某些物質被確定波長的光〔如紫外線〕照耀后能發出一種比激光更長的光，PHPH8.5-9-5是銀光強度較強。PH6。4不發光。溫度，熒光素的乙醇溶液在0度以下沒降低10度熒光量子產率增加3%降至-80度熒光量子率接近100%反之則弱。30度開頭熒光強度降低，37度對異硫氰酸熒光素無影響。溶劑性質對熒光也有影響濃度也對熒光有影響。常用的熒光素有：最常用的染料有FITC和藻紅蛋白類〔PE〕及羅丹明等。FIT〔異硫氰酸熒光素fluoresceinisothiocyante：呈黃綠色，最大激發激光長490NM525nm；與蛋白質結合四甲基異硫氰酸羅丹明〔teramethylrhodamineisothiocyanate)TRITC也是與蛋白質結合比FITC性能好生理條件下對PH不敏感最大激發光波長550NM620NM呈橙紅色熒光與FITC發出的黃綠色熒光形成鮮亮比照常用與免疫熒光組織化學雙重染色。四乙基羅丹明(RB200〕能與細胞內蛋白質結合易溶于乙醇丙酮性質穩定，應用于雙標記示蹤染色，最大發光波570nm最大放射波長595·600nm呈橙紅色染色。花青類染料常用的CY3，CY5CY3570nm650nm。CY5最649nm680nm呈紅色熒光PE〔藻紅蛋白：橙黃色575n；蛋白質結合PerC〔多甲藻黃素葉綠素蛋白：深紅色P〔碘化丙啶：橙紅色620n；488nm波長的氬離子激光激發；AP〔別藻青蛋白：紅色630nm波長的氦氖激光或紅色二極管激光激發。〔acridineorange)AOyuDNA或RNA525nm650nm產生綠色熒光hoechst33258hoechst33342均為非嵌入性熒光染料他們在活細胞中DNAAT序列富集區域的小溝處與DNA結合,活細胞或固定細胞均可從低濃度溶液中攝取該染料，使細胞核染色，故把此染料叫DNA探針hoechst33342和hoechst33258均溶于水保持穩定，hoechst-DNA350nm460nm。DAPIDNA結合。溴化乙啶染色。4.免疫熒光組織化學的根本原理方法？免疫熒光組織技術是用免疫熒光技術檢測細胞或組織內抗原或半抗原物質的方法。依據分子探針與組織細胞內的相應抗原或抗體反響脂多糖受體記病原體等，凡能作為抗原或半抗原的物質均可用免疫熒光技術檢出。5．濾片的種類和用途？⑴激發光濾光片位于光源和顯微鏡之間的光路內其作用是吸取可見光，允許確定波長的熒光激發樣品中的熒光物質。⑵阻斷濾片又稱吸取濾片在目鏡和武警之間的光路中吸取視野內未被標本內熒光物質吸取的激發光，已獲得清楚地熒光影像和保護觀看者的眼睛⑶反光鏡上有一層鋁鋁對紫外線和可見光的藍紫光吸取少反射率大90%以上，課折射激發光轉變光路是激發光趙汝樣品中。⑷隔熱濾片吸取熱量保護其他光學元件。⑸中性濾片課不同程度的吸取可見光，減弱光強度。.6．激光共聚焦顯微鏡的原理？激光掃描共聚焦顯微鏡的原理：傳統的光學顯微鏡使用的是場光源，標本上每一點的圖像都會受到鄰近點的衍射或散射光的干擾；激光掃描共焦顯微鏡(LaserScanningConfocalMicroscope，LSCM)承受點光源照耀樣本，在焦平面上形成一個輪廓清楚的小的光點，該點熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的整個焦平面上清楚的共聚焦圖像。原理圖7．免疫組織化學染色常見的脫片緣由？及防脫片的處理步驟？脫片緣由組織固定脫水透亮不充分，組織切片過厚，組織切片有折疊，過度的熱抗原修復〔高壓微波水煮〕處理或抗原修復液的PH偏離炒作觀看中沖洗方法不正確。防脫片用重鉻酸濃硫酸清潔液浸泡載玻片或則培育用的小蓋片，然后用清水充分再用蒸395%12小時去除擦干或烤干清潔液浸泡只需2小時。檢查玻片是否上膠。把玻片放入用配好的多聚左旋賴氨酸0.01%12-24小時時候后的多聚L-4度的冰箱保存反復使用一個月。sp法〔鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶〕與直接免疫熒光法的區分？鏈霉親和素替代ABC法中的親和素-生物素復合物，形成鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶法，SP法①鏈霉親和素是從鏈霉菌中分別出的一種蛋白，含有四個亞基，鏈霉親和素的四個亞基可以全部和二抗上的生物素結合，故又稱鏈霉菌抗生物素蛋白；由于該放大系統不含生物素，可以免除由內源性生物素所造成的背景染色；②等電點為5.5~6.7因而降低背景著色。③鏈霉親和素不含糖基，不存在與組織中含糖基類物質其反響的現象。免疫組織化學染色樣品制備特點⑴取材：組織標本取材：根本原則:取材速度要快，盡量保持組織穎，以充分保存組織的抗原性。細胞標本取材貼壁生長細胞:取材時，用預熱的PBS輕輕沖洗小蓋片，而后，即可參與固定液。2×105-6細胞/ml50-100μl，參與涂片機內，1000r/min.2min.細胞即可均勻分布在載玻片上3〕涂片法：〔腹水，胸水和心包液〕或氣管、宮頸等分泌物可直接涂片。固定：組織常用固定劑：①10%中性緩沖福爾馬林〔濃甲醛10ml,0.01M,pH7.4,PBS90ml)②4%多聚甲醛磷酸緩沖液(pH7.4)sp法留意事項：①甲醛固定可引起組織抗原打算簇交聯和封閉〔可以通過抗原修復方法來修正2cm×l.5cm×0.3cm0.3cm；20倍以上；8-24小時，過度固定會使抗原表達假陰性；⑤組織固定后應充分水洗。何為二次展片?是指切片在展片過程中，先將組織切片漂移在30%的乙醇溶液中，進展45一50℃的水浴鍋中進展其次次展片，由于酒精視組織不同和石蠟熔點的凹凸，自行調整。核酸分子雜交:DNA或RNA單鏈之間以復性的原理形成雙鏈核酸的過程.原位雜交組織化學技術進展？原位PCR技術熒光原位雜交技術胚胎原位雜交技術雙重和多重原位雜交技術原位雜交結合免疫組織化學技術電鏡原位雜交技術肽核酸原位雜交PCR技術原理:將PCR技術與原位雜交技術結合起來，不轉變四周組織的原有位置，直接在組織、細胞或病原體原位爭論基因變化的技術。依據在擴增反響中所用的dNTP或引物是否標記，原位PCR可分為：直接法原位PCR間接法原位PCR影響雜交體穩定性的因素雜交雙鏈的堿基組成.雜交雙鏈的長度.堿基錯配程度.離子強度.變性劑濃度l類型核酸分子雜交液相雜交固相雜交原位雜交組織化學(ISH)：應用特定標記的核酸探針與組織或細胞中待測的核酸按堿基配對的原則進展特異性結合，形成雜交體，雜交后的信號可以在光鏡或電鏡下進展觀看。可進展細胞內核酸定性、定位的一種技術。DNAcRNA探針寡核苷酸探針原位雜交組織化學根本程序標本制備雜交前處理雜交反響雜交后處理檢測雜交信號。免疫組織化學染色步驟石蠟切片免疫組化染色步驟1.烤片：58℃2-６h；脫蠟和水化：在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中浸泡15－３０min→100﹪酒精Ⅰ、Ⅱ中分別浸泡5min→95﹪、90﹪、80﹪、70﹪2min→PBS3次×3min,置蒸餾水中待用；pH=6.0和0.1mol／L檸檬酸緩沖液煮沸，將切片置于已沸緩沖液中進展1.5min，室溫冷卻，PBS3次×5min；0.1﹪－0.3％TritonX-100浸泡，RT，25min，PBS3次×5min；使抗體滲透進入細胞的方法TritonX-100：使細胞膜脂類溶解Np-40：使細胞膜蛋白質破環Saponin：使細胞膜膽固醇溶解Freezing：使細胞膜穿孔，速凍形成冰晶，溶解后形成小孔。SABC法與免疫組織化學染色其它方法比較?SP法或SAP法〔二〕EnVisionTMSystems原理是將多個抗鼠和抗兔IgG分子與辣根過氧化物酶結合形成聚合物,以代替