抗原刺激誘導的cd4

c4-t淋巴結是一個調節體液和細胞導管免疫功能的細胞。CD4+T細胞通過其膜表面的抗原受體識別由抗原提呈細胞提供的特異性抗原的刺激信號(第一信號),同時在輔助分子信號(第二信號)的作用下,CD4+T細胞開始活化、分裂并主要分化成Th1和/或Th2細胞。CD4+T細胞的分化受許多因素的影響,其中最重要的因素就是細胞因子。IL-12誘導Th1細胞的分化,而IL-4誘導Th2細胞的分化。Th1細胞釋放IFN-γ和LTα,參與細胞介導的免疫反應,而Th2細胞釋放IL-4、IL-5和IL-10,參與體液介導的免疫反應。為此,與靜止型CD4+T細胞相比,活化后的CD4+T細胞不但在膜分子表現型上,而且細胞內基因和細胞因子的產生以及生物功能都發生了明顯改變。為了進一步探討抗原特異性CD4+T細胞的分裂與細胞膜表型和效應功能之間的關系,本研究觀察TCR-TgCD4+T細胞,經特異性抗原刺激后,檢測細胞的分裂與CD25、CD44、CD62L和CD69分子的表達以及細胞內細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-10產生之間的關系。1材料和方法1.1材料表面1.1.1實驗大鼠轉基因小鼠(DO11、10,TCR-Tg)購自Taconic(U.S.A),均為雌性,6~8周齡。1.1.2耐藥抗體和適用基因Per-CP標記的抗CD4、APC標記抗IFN-γ(APC-IFN-γ)、APC-抗IL-2、APC-抗IL-4、APC-抗IL-10、APC-抗CD25、APC-抗CD44、APC-抗CD62L、APC-抗CD69和APC標記的匹配對照抗體均購自美國BD/PharMingen(Becton.Dickinson/PharMingen)公司。PE標記KJ1-26單克隆抗體購自CaltagLaboratories(Burlingame,CA)。白細胞介素(IL)-12購自BD/PharMingen。1.2方法1.2.1cd4+t細胞的分離取小鼠脾和淋巴結,研磨、紗網過濾,然后經Ficoll密度梯度離心(2000r/min,20分鐘),收取單個核淋巴細胞。抗原提呈細胞(APC)的制備:取正常BALB/C小鼠脾細胞與抗小鼠CD4+、CD8+T細胞和抗Thy1抗體和補體孵育,去除T細胞,洗滌2次(1800r/min,10分鐘)后,細胞懸浮于RPMI1640(含10%胎牛血清)培養液中。經γ射線照射(3000rad)后,洗滌細胞2次,吸棄上清,RPMI1640重懸,計數細胞,作為抗原提呈細胞。CD4+T細胞的分離:取OVAT細胞受體轉基因小鼠的單個細胞懸液(TCR-Tg),用PBS+BSA+EDTA緩沖液洗滌2次(1800r/min,10分鐘),按Miltenyi公司說明書敘述的方法加入抗CD4+T細胞磁珠,分離CD4+T細胞。經由抗TCR-Tg特異性抗體(KJ1-26)染色,流式細胞儀分析證明>99%的CD4+T細胞TCR-Tg陽性。1.2.2細胞/ml測定磁珠分離的CD4+-TCR-Tg細胞懸浮于磷酸鹽緩沖溶液中,細胞濃度為10×106細胞/ml。CFSE(購自MolecularProbes公司,Eugene,OR)加入細胞懸液中,其終濃度為0.25μmol/L,細胞與CFSE于室溫孵育7分鐘,然后用PBS洗滌3次,并懸浮于RPMI1640培養液中。1.2.3th1細胞分化CFSE標記的TCR-TgCD4+T細胞和抗原提呈細胞按1∶6細胞比例置于6孔培養板中,同時加入1μg/ml的OVA多肽抗原(OVA323-339)作為刺激組,不加OVA孔為對照組,而加入OVA抗原同時加入2ng/ml的IL-12為Th1細胞分化組。孵育3天后,收集細胞,進行細胞表面染色。細胞內細胞因子產生的檢測,簡言之,收集的細胞計數后,再與抗原提呈細胞1∶6混合,加入OVA多肽刺激5小時,刺激的第一個小時后,加入Brefeld-A(BFA)(購自Sigma)10μg/ml以阻止胞內高爾基體介導的細胞因子轉運。1.2.4洗消液反應細胞表面染色按照常規染色方法進行操作。簡言之,細胞懸液100μl,加入標記的抗細胞表面特異性抗原的抗體,4℃下避光反應30分鐘,洗滌2次(1800r/min,8分鐘)。細胞內細胞因子的染色,將待測細胞用PBS洗滌2次后,加入細胞固定液,室溫固定7分鐘,洗滌2次,然后加入200μl含有通透劑(Sapomin,Sigma)的牛乳緩沖液作用過夜,加入特異性的胞內標記單抗,4℃避光反應30分鐘,洗滌2次,300μl染色緩沖液重懸細胞,流式細胞儀分析實驗結果。1.2.5tcr-tg抑制劑的檢測應用流式細胞儀FACSCalibur進行檢測。以CD4和TCR-Tg抗原表面標志(KJ1-26)雙標記細胞群開窗(gating),以相同種IgG染色為陰性對照。Cellquest收集細胞(總數50000個細胞),并分析流式結果。2結果2.1ova多肽刺激cfse-標記的tcr-tgcd4+t細胞的分離眾所周知,CD4+T細胞經抗原刺激后,開始活化和分裂,在IL-12的作用下,分化為Th1細胞。為了進一步闡明細胞分裂的次數和是否IL-12促進細胞的分裂,我們利用OVA抗原多肽刺激CFSE-標記的抗原特異性的TCR-TgCD4+T細胞,在抗原提呈細胞存在的情況下,3天后檢測細胞的分裂。從圖1可以看出,當缺乏OVA多肽時,CD4+T細胞沒有任何分裂,可見只有一個細胞峰。當OVA多肽刺激3天后,大多數CD4+T細胞分裂1~5次,而且分裂2~3次的細胞占大多數。當IL-12加入OVA多肽刺激的細胞后,IL-12促進可細胞的分裂,可見3~4次分裂的細胞占大多數。2.2cd65p分子的表達為了探討細胞的分裂和細胞表面活化分子和粘附分子之間的關系,我們檢測抗原特異性CD4+T細胞在抗原刺激前后細胞膜表面標記的變化。從圖2可以看出,隨著細胞的分裂,細胞膜表面分子的表達有3種類型的變化:①CD25和CD44分子在未活化CD4+T細胞的表達很低,當受到抗原的刺激后,在細胞分裂之前,CD25和CD44分子的表達明顯增加,隨著細胞分裂次數的增加,CD25和CD44分子也隨著增加。②CD62L分子高表達于未經抗原刺激的CD4+T細胞,隨著細胞分裂次數的增加,CD62L的表達逐漸下降。③同樣地,CD69不表達于未經抗原刺激的細胞,經抗原刺激后,CD69在沒有分裂的細胞(分裂0細胞)上的表達沒有明顯的增加,但當細胞分裂1次后,幾乎所有的細胞均表達CD69,隨著細胞分裂次數的增加,CD69分子的表達隨之下降。IL-12對這些膜分子的表達未見有明顯影響。2.3抗原刺激對il-2表達的影響為了進一步探討細胞分裂與細胞因子產生之間的關系,CFSE-標記的TCR-TgCD4+T細胞,在抗原提呈細胞存在的情況下,利用OVA多肽刺激TCR-TgCD4+T細胞。3天后,收集細胞,在抗原提呈細胞存在的情況下,再一次利用OVA多肽刺激TCR-TgCD4+T細胞,同時加入BFA阻止胞內細胞因子釋放,5小時后收集細胞、固定、破膜后,進行細胞內細胞因子染色。結果如圖3所示,在初次培養時未經抗原刺激的細胞,細胞沒有分裂,這些細胞經抗原刺激5小時后,可見37%的細胞產生IL-2,0.2%的細胞產生IFN-γ,1%左右的細胞產生IL-4和0.6%左右的細胞產生IL-10。在初次培養后,再一次抗原刺激時,IL-2陽性的細胞減少。隨著細胞分裂次數的增加,IFN-γ、IL-4和IL-10產生的細胞逐漸增加。IL-12增加IFN-γ產生的陽性細胞,促進分裂3~4次細胞產生IFN-γ,抑制IL-4和IL-10產生細胞,但對細胞的分裂次數未見有明顯影響。3胞內分裂和細胞細胞因子的表達免疫細胞的活化和增殖是免疫反應成功的一種標記。CD4+T細胞對抗原和致有絲分裂原刺激的反應性,表現在細胞膜表面活化分子和粘附分子的表達、細胞的分裂和細胞因子的產生。最適應的免疫反應條件除了需要高濃度的抗原通過T細胞抗原受體傳遞激活的信息(第1信號)外,還需要由抗原提呈細胞通過共刺激分子所提供的第2信號,這些多種信號的共同作用促使T細胞的分裂。經過分裂后,最終分化成為效應T細胞,產生效應細胞因子如IFN-γ(Th1)和IL-4(Th2)。目前許多研究均集中于觀察T細胞的功能和表現型之間的相關性,但有關同時檢測細胞內的分裂次數與細胞表面活化標志和細胞內細胞因子的表達的報道甚少。為此,我們探討了當抗原特異性CD4+T細胞經抗原刺激后,細胞的分裂與細胞表面型和細胞因子產生之間的關系。我們的結果提示,當細胞受到刺激后某些細胞表面分子表達的高低和細胞因子產生的多少與細胞分裂有著一定的關系。從圖2可以看出,當CD4+T細胞受到抗原刺激后,在細胞分裂之前CD25的表達增加,當細胞第一次分裂以后,CD25的表達達到高峰,并維持在較高水平。而CD69分子是在細胞第一次分裂時表達最高,隨著細胞分裂次數的增加其表達逐漸減少。這些結果進一步證實了CD25和CD69分子均是CD4+T細胞活化的標志,但是我們的結果提示,與CD25分子相比,CD69的表達與細胞分裂與否有著更加密切的關系。細胞粘附分子CD44和CD62L的表達也與細胞的分裂有著密切的關系,CD44分子隨著細胞的分裂而增加,但是CD62L隨著細胞的分裂而減少。為此,觀察CD44和CD62L的表達的分子密度來判別初始T細胞和效應T細胞。這些分子的改變也提示初始T細胞和效應T細胞在組織器官分布的差異。此外,我們還利用細胞內細胞因子的檢測作為CD4+T細胞效應功能的標志,在單個細胞水平上我們證實IL-2與細胞的活化有關,而IFN-γ、IL-4和IL-10與細胞的分裂有關,隨著細胞分裂次