非編碼RNA研究技術總結長鏈非編碼RNA（longnoncodingRNA，lncRNA）是一類長度＞200bp的RNA，由RNA聚合酶Ⅱ轉錄，lncRNA具有保守的二級結構,大部分不編碼蛋白質。LncRNA發揮功能的方式很廣，可以與蛋白、DNA和RNA相互作用，參與多種生物學過程的調控。主要包括基因組表觀遺傳修飾、調控轉錄后翻譯、發揮ceRNA、增強子RNA作用等，從而對細胞的增殖、分化、遷移、凋亡、免疫等發揮調控作用。非編碼RNA可火了，miRNA大火燒了十幾年，現在慢慢地把lncRNA的領域也給點著了?，F在可能連實驗室的插槍頭阿姨都知道絕大多數的RNA分子并不翻譯，這非編碼RNA(noncodingRNA)，包括miRNA、lncRNA等。目前主要研究方向集中在非編碼RNA及其相互結合的DNA、RNA、蛋白質等科學問題，而科學問題的解答依賴于實驗技術的創新使用和革命。IncRNA可以海陸空全面調控細胞功能，厲害了，其實主要指lncRNA，而miRNA、siRNA主要作用于mRNA層面，本文按非編碼RNA的三個調控維度，就當前主要的實驗技術簡單介紹一下。(一)DNA維度1）作用的ncRNA類型：lncRNA等2）研究方法介紹有：和DNA序列結合的調控目的無非是①阻止下游基因的轉錄②把轉錄因子、甲基化酶等招惹過來修飾DNA序列。他們的共同特點是和解鏈的DNA的某一條鏈結合，那么研究方法包括1.RNA原位雜交(RNAinsituhybridization)檢測該ncRNA是否位于核內，如果不在核內，那就不用考慮和DNA作用了。RNA原位雜交是指將特定標記的已知順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細胞標本或組織標本上進行。根據RNA序列設計cDNA、cRNA探針，對目標進行定位。2.ChIRP(chromatinisolationbyRNApurifications)是一項通過純化RNA分子從而獲得其結合的染色質片段(包括RNA結合蛋白與基因組DNA)的實驗方法。大概流程：首先細胞交聯，使lncRNA、染色質及被固定連接；隨后通過超聲將染色質打斷，并使用帶有生物素標記的tilingoligos與長鏈非編碼RNA分子雜交；之后利用親和素磁珠純化長鏈非編碼RNA及其結合的染色質片段；后續分析和測序。這種互作模式是RNA-Protein，那么ncRNA可以和調控DNA的蛋白結合，也可以和細胞質內的蛋白質結合，發揮不同效應。1.CLIP-seq：鑒定與特定RNA結合蛋白相互作用的RNA分子CLIP-seq也被稱為HITS-CLIP，是將紫外交聯免疫共沉淀技術(CLIP)與高通量測序技術相結合的技術。大概流程為：首先通過紫外照射將細胞內的RNA分子與RNA結合蛋白進行耦聯；細胞裂解，免疫共沉淀，核酸酶(RNase)將共沉淀的RNA切割，只保留蛋白質內部的RNA片段；通過5'末端放射性標記RNA分子及SDS電泳，選擇性地回收目的蛋白結合的RNA片段；最后高通量測序。其可以衍生了許多變異的CLIP-seq方法，例如增強了交聯強度的PAR-CLIP和能夠精確鑒定RNA分子中蛋白質結合位點的iCLIP等。2.mRNA-蛋白研究方法：利用Poly(A)尾首先紫外交聯(UV-CL)，將mRNA與蛋白質的相互作用固定連接；隨后使用耦聯磁珠的Oligo(dT)富集純化mRNA蛋白復合物，經過洗滌及降解RNA等步驟，最后將獲得的蛋白質進行質譜分析。3.EMSA凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay）用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物和非結合的探針。RNA-復合物比非結合的探針移動得慢。4.RIP(RNA-immunoprecipitation)RNA免疫沉淀可以用來研究組織或活細胞中蛋白質和RNA之間的相互作用。該方法的原理是采用針對目標蛋白的抗體,把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來,經過