華北落葉松化感物質及其對自身種子萌發和胚根生長的影響

過去，人們常常考慮森林更新的失敗原因，但對生化因素的影響往往低估。事實上，一些樹種更新和重建的失敗與化感作用有關。發芽作為植物釋放化感物質的重要途徑之一，已經被發現和研究。大量事實表明，植物可以通過發芽產生化感作用，對其他植物及其自身種子的發芽和幼苗的生長有不同程度的抑制作用，這對種子群的數量和未來的種群密度產生了一定的影響。華北落葉松(Larixprincipis-rupprechtii)為松科落葉松屬的落葉喬木,是我國華北地區中山以上山地的重要速生用材林樹種.而華北落葉松連栽或純林導致生產力下降和地力衰退一直是阻礙我國林業生產的重要問題,同時,樹下少幼苗或無幼苗,不利于森林更新.近幾年來,對落葉松的化感研究已有一些報道,如吳俊民等研究了落葉松-水曲柳混交林中落葉松枯枝落葉對水曲柳生長的影響;楊立學研究了落葉松與胡桃楸之間的化感作用.華北落葉松體內富含特殊氣味的揮發物,但對華北落葉松枝葉揮發物的化感作用尚未見文獻報道.為此,本文在密閉干燥器中進行了華北落葉松枝葉天然揮發物和揮發油對自身種子萌發和植株生長影響的試驗,旨在進一步研究華北落葉松的化感作用,為我國華北落葉松林的可持續經營和發展提供基礎資料.1材料和方法1.1華北落葉松種子和種子采集2007年4月中旬,在甘肅子午嶺連家砭林場(35°53′—36°10′N,108°20′—108°39′E)的華北落葉松人工純林內采集自然狀態下生長良好的華北落葉松枝葉,用保鮮膜包裹后帶回實驗室備用.華北落葉松人工林屬幼齡林階段,20世紀80年代造林,平均樹高7.6m、胸徑為12.5cm,林相整齊,干形通直.華北落葉松種子由子午嶺連家砭林場提供,置布袋中于4℃冰箱中保存.1.2測試方法1.2.1揮發油的提取按照2000版《中國藥典》附錄XD.水蒸汽蒸餾法提取、收集揮發油,將新鮮陰干的華北落葉松枝葉切碎后打成粗粉,過0.5mm篩,冷水浸泡4h后,用揮發油測定器提取5h,蒸餾液用乙醚萃取3次,合并萃取液,無水硫酸鈉干燥,使有機相中乙醚在水浴中蒸發,得到有特殊香味的淺黃色油狀物,即為華北落葉松枝葉的揮發油,得油率為0.18%(V/M).將揮發油密封、冰箱保存,供試.1.2.2種子萌發和發芽試驗參照曾任森等的方法,試驗分自然揮發組和揮發油組(每組分揮發物和空白對照).在干燥器上部的貯藏室分別進行種子萌發和露白種子生長試驗,分別模擬的是種子萌發階段和生長初期階段.在直徑20cm、高30cm的干燥器底部的干燥室,分別放50g新鮮落葉松枝葉和0.1ml華北落葉松揮發油作為揮發物來源;對照的底部不放任何東西.華北落葉松種子用0.3%的高錳酸鉀溶液消毒,再用蒸餾水浸泡24h,以待萌發.精選出大小基本一致的種子均勻擺放在鋪有2層濾紙的直徑10cm的培養皿中,每皿放50粒,3次重復,干燥器加蓋,在室溫20℃～25℃自然光照下培養.每天加適量蒸餾水,打開干燥器通氣15min,每天記錄發芽數(以胚根突破種皮為準),第9天結束發芽試驗,測量其胚根長、胚軸長、鮮質量;精選大小基本一致預先催芽(芽長1～2mm)的種子,每皿放20粒,均勻擺放在鋪2張濾紙的直徑為10cm的培養皿中,3次重復,干燥器加蓋,在室溫20℃～25℃自然光照下培養.每天加適量蒸餾水,打開干燥器通氣15min,培養10d測量其胚根長、胚軸長和鮮質量.1.2.3gc/ms色譜條件采用GRACEGC-MS2000氣質聯用儀.色譜條件:SF-54色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm),進樣口溫度250℃,柱流速1ml·min-1,載氣為氦氣,進樣量1μl,無分流進樣.色譜程序升溫條件:起始溫度60℃,保持2min,升溫速率5℃,升至250℃,保持5min,然后以10℃·min-1升至280℃,保持0.5min.質譜條件:離子源為EI源,接口溫度為250℃,離子源溫度為200℃,檢測電壓350V,電離電壓70eV,電子能量0.5eV,柱壓76kPa,質子掃描范圍21～411amu.1.3發芽數的測定種子萌發速度參照Pander等的方法,用發芽速度指數(I)表示:I=2×(6X1+5X2+4X3+3X4+2X5+X6)式中:X為每隔24h發芽的種子數;X1為24h記錄的發芽數;X2為48h記錄的發芽數,依次類推.生物活性測定參照Williamson等的方法,采用響應指數(RI)度量化感作用的類型和強度,算式為:RI=1-C/T(當T≥C)RI=T/C-1(當T<C)式中:C為對照值,T為處理值.RI<0為抑制,RI>0為促進,絕對值的大小與作用強度一致.生物測定單株數據取培養皿中各植株平均值,試驗數據使用Excel、SPSS12.0等軟件進行統計分析,利用單因素方差分析(One-WayANOVA)和最小顯著差異法(LSD)以及新復極差法(Duncan)比較各處理組間生物活性的差異顯著性.2結果與分析2.1葉松揮發油中的化合物揮發油樣品經氣質聯用分析后,所得質譜經數據處理系統對其內存譜庫自動檢索,結合人工譜圖解析,確定了華北落葉松枝葉揮發物的主要化學成分,并將總離子流色譜圖中的峰值較大的組分進行歸一化,求出各自相對含量(表1).由表1可以看出,華北落葉松揮發油中含量較大的化合物有20種,占總揮發物的75.30%.其中烷烴2種,相對含量占3.88%;萜類化合物17種,占70.04%;芳香族化合物1種,占1.38%.主要化合物有大根香葉烯(11.35%)、1-異丙基-4,7-二甲基-1,2,4a,5,8,8a-六氫萘(6.53%)、石竹烯(5.84%)、長葉松節烷(5.23%)、7-甲基-4-亞甲基-1-(1-甲基乙基)-1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氫萘(5.21%)、(E)-3,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇(5.17%)、.tau.-Muurolol(4.55%)、α-杜松醇(4.31%)、α-石竹烯(4.22%)等.華北落葉松枝葉揮發油中絕大多數為萜烯類及其含氧衍生物,有5個單萜,12個倍半萜.2.2自然揮發油對4個月生存率的影響由表2可以看出,從第4天到發芽試驗結束,華北落葉松揮發物對自身種子發芽率的影響逐漸增大,然后趨于平緩,而且試驗組均比對照組低.經單因素方差分析,從第6天到第9天,華北落葉松枝葉揮發物對自身種子發芽率影響都達到顯著差異水平,自然揮發試驗組第6天至第8天達到極顯著水平,揮發油試驗組在第6、8、9天也達到顯著差異水平.試驗表明,華北落葉松的自然揮發物和揮發油對自身種子萌發率和萌發速度均產生抑制作用(表3).其中自然揮發組和揮發油組的發芽率分別比對照低7.33%和12.00%,萌發速度指數分別比對照減少35.56%和28.06%.華北落葉松自然揮發組對自身種子的萌發率抑制作用顯著,對自身種子的萌發速度抑制作用極顯著;而揮發油組對自身種子的發芽率、萌發速度的抑制作用均極顯著.響應指數RI均為負值,且萌發速度的RI絕對值大于萌發率的RI絕對值,說明華北落葉松的揮發物對自身種子的萌發有抑制作用,但對萌發速度的抑制作用更強,影響更明顯.2.3自然揮發物對植株胚根和胚軸生長的影響由表4可以看出,揮發物對種子萌發后胚根和胚軸的生長都具有顯著的抑制作用.在種子萌發階段,自然揮發物對其胚根的生長影響極顯著,試驗組的胚根長、胚軸長分別比對照減少42.4%和28.5%;揮發油對其胚根和胚軸生長均產生顯著的影響,試驗組的胚根長、胚軸長分別比對照減少17.5%和22.1%.在植株生長初期階段,自然揮發物對植株胚根生長影響不顯著,但對其胚軸生長影響顯著,試驗組的胚根長、胚軸長分別比對照減少20.4%和21.5%;揮發油對胚根生長影響極顯著,對胚軸生長影響顯著,試驗組的胚根長、胚軸長分別比對照減少47.7%和13.0%.對化感響應指數進行簡單的加和可看出,種子萌發階段自然揮發物對華北落葉松植株胚根長和胚軸長的抑制作用大于生長初期階段,揮發油的影響則相反.在整個生長過程中,揮發物對胚根生長的抑制作用大于胚軸生長的抑制作用,自然揮發物的抑制作用大于揮發油.2.4揮發油組與對照組減少揮發油組實驗結果比較華北落葉松揮發物在種子萌發階段和生長初期階段對胚根、胚軸鮮質量都具有不同程度的影響(表5).在種子萌發階段中,自然揮發組的胚根、胚軸鮮質量分別比對照減少32.9%和33.3%,揮發油組則分別比對照減少25.0%和21.4%;在生長初期階段中,自然揮發組的胚根、胚軸鮮質量分別比對照減少18.6%和26.3%,揮發油組則分別比對照減少50.5%和5.0%.對化感響應指數進行簡單的加和,種子萌發階段自然揮發物對華北落葉松植株鮮質量的影響大于生長初期階段,揮發油的影響則相反.在整個生長過程中,揮發物對胚根鮮質量的抑制作用大于胚軸鮮質量,自然揮發物對鮮質量的抑制作用大于揮發油的抑制作用.3其他化感作用對華北落葉松人工林生物固定的影響及其經營對策生測試驗結果表明,華北落葉松枝葉的自然揮發物和揮發油對自身種子萌發都表現出延遲萌發和抑制萌發作用,雖然對胚根和胚軸的伸長量、鮮質量減少的程度不同,但都產生明顯的抑制作用.說明華北落葉松枝葉的揮發物具有化感潛勢,可抑制自身生長,即有自毒作用.華北落葉松枝葉揮發油中存在較多的萜類化合物,揮發油對自身種子萌發和幼芽生長所表現的抑制作用,可能與揮發油中萜類化合物含量較高有關.許多單萜和倍半萜以揮發油為主要存在形式,對昆蟲具有引誘、忌避和傳遞信息等效應,對植物有殺菌和抵制作用.已有研究證實,萜類化合物是自然界中常見的化感物質,常通過揮發、淋溶、分泌和植物殘體腐解等途徑進入環境中,對周圍植物產生影響.華北落葉松枝葉揮發物的化感作用影響自身的更新,可能是華北落葉松人工純林退化的一個原因,并且會影響到周圍其他物種的生長和分布,從而導致其林分結構單一,生態幅減小,群落不穩定.針對華北落葉松枝葉揮發性化感物質的自毒作用,建議采取以下經營對策:1)在落葉松林中搭配種植其他樹種,以便吸收一部分化感物質,減少化感物質的積累.同時營造混交林能有效地防止地力衰退,促進落葉松的生長發育.如在東北林區,可與落葉松混交的喬木樹種有水曲柳、胡桃楸、白樺等,灌木有錦雞兒、東北赤楊等.西北林區可引以為鑒,選擇能夠相互促進生長的樹種混交種植,人為地控制種群分布格局,避免群落中由于排斥作用而出現種群的單一化,增強群落對外界干擾的抵抗力.2)通過人工林疏伐,改善林下光照和小氣候條件,促進林下植被的發育,從而打破落葉松人工林群落結構單一化的格局,有利于養分循環和地力恢復,并可將落葉松種內競爭和化感作用對自身生長的影響降低到最小,使單位面積獲得最高的生產力和生物量.3)加強華北落葉松人工林可持續經營和發展技術,包括科學選育良種、營林栽培措施及經營管理模式、林地生產力及生態質量變化等方面的研究,特別是對華北落葉松人工林生態系統和生物多樣性進行系統的研究,揭示華北落葉