曲酸對(duì)細(xì)菌的生物活性研究

曲線(xiàn)酸是一種含有酶分解的親水酸，適用于食品加工。曲酸與目前在食品添加劑中廣泛應(yīng)用的苯甲酸、山梨酸及其鹽類(lèi)比有如下優(yōu)點(diǎn):水溶性好,無(wú)需先溶解于有機(jī)溶液中再添加到食品中;對(duì)人體無(wú)刺激性,并可抑制亞硝酸鹽生成致癌物;不為細(xì)菌所利用,抗菌效力更強(qiáng)、更廣泛。曲酸的抑菌作用和作為防腐劑的應(yīng)用已有一些相關(guān)報(bào)道,本研究中針對(duì)曲酸對(duì)于食品中常見(jiàn)污染菌的抑制作用進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)研究,比較,確定了曲酸對(duì)各種供試菌的抑制程度及其相應(yīng)最小抑菌濃度,從而為曲酸在食品方面的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1菌株salm細(xì)菌5種:大腸桿菌(Escherichiacoli),金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),豬傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphi),銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa),枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis);酵母2種:啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae),產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis);霉菌2種:桔青霉(Penicilliumcitrinum),黑曲霉(Aspergillusniger),均為本學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。1.2金屬絲樣品由廈門(mén)市合成生物工程技術(shù)有限公司提供,經(jīng)檢測(cè)純度>99%。1.3培養(yǎng)基(1)液體培養(yǎng)基細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,酵母和霉菌采用5°P的麥芽汁作為培養(yǎng)基。(2)固體培養(yǎng)基用上述液體培養(yǎng)基加2%的瓊脂制成。1.4無(wú)菌試驗(yàn)方法(1)細(xì)菌和發(fā)酵菌的激活將各供試細(xì)菌和酵母菌種分別接種于新配制的液體培養(yǎng)基中,適宜溫度下(細(xì)菌37℃,酵母菌28℃)培養(yǎng)24h后,制成菌懸液。(2)培養(yǎng)基的制備分別取上述細(xì)菌、酵母菌的菌懸液2mL加入到裝有60mL液體培養(yǎng)基(分別含有0.2%或0.3%的曲酸)的300mL三角瓶中,并以不加曲酸的培養(yǎng)基作為對(duì)照,37℃(細(xì)菌)或28℃(酵母菌)搖床培養(yǎng),每隔6h測(cè)定一次吸光度值A(chǔ)560nm,連續(xù)測(cè)定9次。(3)角瓶培養(yǎng)基的制備將上述供試的桔青霉、黑曲霉斜面活化制成孢子懸浮液,搖勻后各取2mL接種到裝有內(nèi)含0.5%曲酸的60mL麥芽汁培養(yǎng)基的300mL三角瓶中,同樣以不加曲酸的培養(yǎng)基作為對(duì)照。28℃搖床培養(yǎng),每隔12h各取一瓶培養(yǎng)液,3000r/min離心10min,再用蒸餾水洗滌3次,105℃烘干至恒重,稱(chēng)量并計(jì)算菌體干重。1.5生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定mic值上述各細(xì)菌或酵母的菌懸液以及霉菌的孢子懸浮液分別取0.1mL涂布到含有不同曲酸量的平板上,37℃(細(xì)菌)或28℃(酵母菌、霉菌)下培養(yǎng),每隔24h觀(guān)察各平板菌落的生長(zhǎng)情況并計(jì)算MIC值。曲酸濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%。1.6曲酸平板的制備將濃度為2.5%的曲酸母液分別置于80℃、100℃和121℃處理30min后,定量加入到各培養(yǎng)基中,制成含0.2%和0.4%的曲酸平板,同MIC測(cè)定法進(jìn)行抑菌比較試驗(yàn)。1.7平板式菌株的制備采用濾紙圓片法。圓濾紙片是將102型濾紙用打孔器制成直徑為10mm的圓片,121℃滅菌后備用。上述各菌株的菌懸液或孢子懸浮液0.1mL加入各適溫培養(yǎng)基,傾注平板后,用無(wú)菌鑷子將分別在1%曲酸溶液或1%苯甲酸鈉溶液中浸泡10min的濾紙片貼注平板,并以無(wú)菌水作為對(duì)照。每菌株平行3個(gè)平板,37℃(細(xì)菌)或28℃(酵母菌、霉菌)培養(yǎng)24h(細(xì)菌)和48h(酵母菌、霉菌)后,觀(guān)察抑菌效果并測(cè)量抑菌圈大小。2結(jié)果與討論2.1曲線(xiàn)酸的抗菌性2.1.1曲酸對(duì)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)和抑制作用的影響實(shí)驗(yàn)首先采用分光光度法比較了曲酸對(duì)于4種經(jīng)常性引起食品污染的細(xì)菌大腸桿菌、豬傷寒沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑制作用效果,結(jié)果如圖1～圖4所示。從圖1～圖4的動(dòng)態(tài)觀(guān)察測(cè)試結(jié)果可以看出,曲酸對(duì)這4種細(xì)菌均有明顯的抑制作用,且隨著曲酸的濃度提高,抑菌作用效果逐漸加強(qiáng)。這其中,曲酸對(duì)革蘭氏陽(yáng)性的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌能力明顯強(qiáng)于對(duì)革蘭氏陰性的大腸桿菌和豬傷寒沙門(mén)氏菌的抑菌能力。當(dāng)曲酸濃度為0.2%和0.3%時(shí),革蘭氏陰性菌在培養(yǎng)過(guò)程中仍有一定生長(zhǎng),而革蘭氏陽(yáng)性菌,特別是銅綠假單孢菌幾乎不生長(zhǎng),2菌體生長(zhǎng)曲線(xiàn)基本上重合在一起。為了進(jìn)一步研究曲酸對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用,把曲酸的濃度降低到0.1%和0.05%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5低濃度曲酸對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌曲線(xiàn)中可以看出,曲酸對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌功能最好,0.1%的曲酸就可以起到根本性地抑制銅綠假單胞菌生長(zhǎng)的良好作用效果。另外,圖6和圖7表示了曲酸對(duì)于2種酵母菌啤酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母菌生長(zhǎng)抑制作用的分光光度法試驗(yàn)結(jié)果。從圖7結(jié)果可見(jiàn),曲酸對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母有較好的抑制作用,0.3%曲酸呈現(xiàn)出明顯的作用結(jié)果。但對(duì)于啤酒酵母,實(shí)驗(yàn)觀(guān)察到盡管在搖床培養(yǎng)液中加入了一定濃度的曲酸,但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)也會(huì)跟未加曲酸的對(duì)照培養(yǎng)液一樣,很快變?yōu)榛鞚帷Ｔ谂囵B(yǎng)18h后,添加曲酸的試樣和未加曲酸的對(duì)照組同樣都要經(jīng)過(guò)稀釋30倍才能測(cè)出其吸光度值A(chǔ)560nm,這說(shuō)明濃度為0.3%的曲酸對(duì)啤酒酵母的抑制作用不明顯。實(shí)驗(yàn)后來(lái)發(fā)現(xiàn)0.8%和1.0%濃度的曲酸可以表現(xiàn)出對(duì)啤酒酵母菌體生長(zhǎng)的明顯影響作用。2.1.2曲酸對(duì)設(shè)計(jì)植物的抑制作用實(shí)驗(yàn)隨后采用菌體量法比較了曲酸對(duì)桔青霉和黑曲霉的抑制作用,其結(jié)果見(jiàn)圖8和圖9。從圖8和圖9可見(jiàn),當(dāng)培養(yǎng)液中曲酸的濃度為0.5%時(shí),桔青霉和黑曲霉試驗(yàn)組的菌體量曲線(xiàn)與未加曲酸的對(duì)照組曲線(xiàn)幾乎完全相重合,表明曲酸對(duì)桔青霉和黑曲霉的生長(zhǎng)不施加任何抑制作用,有報(bào)道稱(chēng)包括曲霉和青霉的多數(shù)絲狀真菌能在通常條件下合成產(chǎn)生一定量的曲酸,因而在菌體細(xì)胞內(nèi)可能已經(jīng)形成了相應(yīng)的曲酸對(duì)抗或耐受機(jī)制體系,上述現(xiàn)象可能與此有關(guān)。2.2曲酸對(duì)三種細(xì)菌生長(zhǎng)的影響選用大腸桿菌、豬傷寒沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌、啤酒酵母菌、桔青霉和黑曲霉8種菌,測(cè)定曲酸抑制的MIC,結(jié)果見(jiàn)表1。與上面結(jié)果一樣,雖然曲酸未能表現(xiàn)出對(duì)于青霉和黑曲霉菌體生長(zhǎng)的影響作用(在最高試驗(yàn)濃度為0.6%情況下效果也很不明顯),而對(duì)于啤酒酵母,曲酸濃度需高達(dá)0.5%時(shí),方有較好的抑制作用,其MIC定為0.5%。但是,當(dāng)培養(yǎng)基中曲酸含量達(dá)到0.3%時(shí),曲酸對(duì)于其他各供試菌均有很好的抑菌效果,其中,曲酸對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用最顯著,0.1%就能達(dá)到很強(qiáng)的抑制作用,但從其完全抑制該菌生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果上看,可以確定其MIC為0.2%。對(duì)其他3種細(xì)菌大腸桿菌、豬傷寒沙門(mén)氏菌和枯草芽孢桿菌也表現(xiàn)出尚佳的抑制效果,MIC分別為0.3%、0.4%和0.4%。同樣,曲酸對(duì)假絲酵母的抑菌效果也較好,MIC為0.2%濃度的曲酸就能達(dá)到徹底的抑菌作用。2.3曲酸對(duì)細(xì)菌和酵母菌生長(zhǎng)的影響從表2可以看出,曲酸經(jīng)80℃、100℃和121℃處理30min后,再以上述MIC測(cè)試方法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,熱處理后曲酸的抑菌效果與未經(jīng)熱處理的曲酸的抑菌效果相同,仍有良好的抗菌效力,說(shuō)明曲酸對(duì)熱穩(wěn)定性良好,可與加工食品共同加熱滅菌,這對(duì)曲酸在各種食品中的實(shí)際應(yīng)用十分有利。由表3知,與曲酸一樣,相同1%濃度的苯甲酸鈉亦未能呈現(xiàn)出對(duì)于曲霉和青霉的任何抑制作用,但是,曲酸抑制細(xì)菌和酵母菌繁殖生長(zhǎng)的能力明顯強(qiáng)于苯甲酸鈉。苯甲酸鈉不能對(duì)于酵母菌的生長(zhǎng)給予任何可觀(guān)察到的有效影響,而曲酸則對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母表現(xiàn)出非常清楚的抑菌效果,對(duì)啤酒酵母也有一個(gè)微小的作用結(jié)果。并且曲酸能夠?qū)τ诒郊姿徕c不能起到影響能力的豬傷寒沙門(mén)氏菌呈現(xiàn)出了清晰透亮的抑菌圈,同為革蘭氏陰性菌的大腸桿菌,其抑菌圈直徑超過(guò)了11mm。在其他細(xì)菌的抑菌圈直徑上,二者之間也至少存在0.5mm以上的距離差別,即苯甲酸鈉與曲酸的抑菌作用效果濃度之間,大約相差0.1%以上的等級(jí)差異。2.4結(jié)果采用濾紙圓片法對(duì)曲酸和苯甲酸鈉的抑菌能力進(jìn)行了試驗(yàn)比較,結(jié)果如表3所示。另外,實(shí)驗(yàn)中為了防止瓊脂不凝固,培養(yǎng)基pH都調(diào)為中性,而曲酸和苯甲酸鈉的抑菌效果在酸性或偏酸性的條件下才較強(qiáng),所以,本實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明曲酸的抑菌pH范圍較廣。3曲酸及抗菌活性(1)曲酸對(duì)食品中常見(jiàn)的細(xì)菌、酵母菌有較好的抑制作用,特別對(duì)細(xì)菌的抑制效果更明顯,0.2%～0.4%的曲酸就能對(duì)各供試細(xì)菌起到很好的抑制作用。曲酸對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用顯著,0.1%就能達(dá)到很強(qiáng)的抑制作用;曲酸對(duì)產(chǎn)朊假絲酵母有較好的抑制作用,0.2%的曲酸可以