大球蓋菇黃酮類化合物提取工藝及其抑菌效果研究

大球蓋奧，又名圓金針澤、圓熱蓋奧和酒紅色球蓋奧。它的營養成分豐富，人工種植方便。這是聯合糧團（fao）推薦的發展中國家植物之一。黃酮類化合物是指由中央三碳原子和兩個酚胺環（a-環和b-環）組成的一套化合物。它在甲醇、乙醇、水等極性溶劑中溶解，不容易溶于氯仿、苯等有機溶劑。黃酮類化合物的基本骨架為c6-c3-c6。它廣泛分布于植物世界。它是一種非常有用的藥物。它是許多藥物和提取物的主要成分。具有寄生蟲、抗炎、從而保護心臟系統和粘膜的生理活性。人們對黃酮類化合物的抗菌性進行了實驗和研究。結果表明，一些植物的黃酮類化合物具有良好的抗菌效果。例如，從大豆中提取的異黃酮類化合物對芽細胞菌、金黃色細菌、梨菌和米曲霉有良好的抗菌效果?，F在，大麥蓋蘑菇主要集中在營養成分分析和多孔生理活性的研究上。關于黃酮類化合物的研究是關于阻力，但沒有關于它們的抗菌試驗的報告。在這項工作中，我們優化了大麥蓋蘑菇的提取過程，并對大麥蓋蘑菇的抗菌性進行了評價。為大麥蓋蘑菇的綜合開發利用提供了基礎。1材料和方法1.1酵母、培養基和試劑大球蓋菇,采自福建省將樂縣;馬鈴薯,購自福州永輝超市;大腸桿菌、青霉菌、啤酒酵母,福建農林大學食品科學學院微生物實驗室提供;瓊脂糖粉,青島瓊脂制造公司;牛肉粉,阜陽雙旋生物制品廠;蔗糖,天津大茂化學試劑廠;蘆丁標準品,北京市化學試劑廠;硝酸鋁、亞硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、甲醇、乙酸乙脂等均為分析純試劑.1.2壓力蒸汽滅菌器GFSJ-8型高效粉碎機,無錫寶輝機械制造有限公司;756P型紫外-可見分光光度計,上海光譜儀器有限公司;1601AMP8-1型電子天平,日本島津公司;HH-6型數顯電子恒溫水浴鍋,常州國華電器有限公司;LHS-150SC型恒溫恒濕箱,上海一恒科技有限公司;CA-1480-2型潔凈工作臺,上海凈化設備廠;LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫療器械廠;85-2A型數顯測速恒溫磁力攪拌器,江蘇省金壇市榮光儀器制造有限公司.1.3測試方法1.3.1大球蓋菇樣品中黃酮含量的測定大球蓋菇黃酮類化合物提取工藝流程:大球蓋菇→60℃烘干→粉碎→過60目篩→加溶劑提取→抽濾→定容→定量分析.準確稱取1.0g大球蓋菇粉末,分別用水、丙酮、乙酸乙脂、無水乙醇為溶劑,以物料比1∶60,在60℃的溫度下回流提取2h,趁熱抽濾,倒入100mL的容量瓶,并用相應的溶劑定容到100mL,即為待測液.然后分別測定不同溶劑樣品中的黃酮含量,獲得黃酮含量最高的溶劑(為乙醇)用于后續實驗.1.3.2蘆丁含量y的測定用分析天平精確稱取12.5mg蘆丁(120℃干燥至恒重),用少量70%的乙醇在燒杯里微熱溶解,倒入50mL容量瓶,定容至50mL,混合均勻后即配成0.25g/L的蘆丁標準溶液.取6個10mL具塞管,標為1~6號,分別加入蘆丁標準溶液(0.25g/L)0.00,0.20,0.40,0.60,0.80,1.00mL,加入5%亞硝酸鈉溶液0.4mL混勻,放置6min,再加入10%硝酸鋁溶液0.4mL,混勻,放置6min,最后再加入1moL/L氫氧化鈉溶液4.0mL,用70%的乙醇補足到刻度,搖勻,放置15min.以未加蘆丁標準液者為空白,用分光光度計在510nm處測吸光度,得到吸光度A與蘆丁含量Y之間的回歸方程:Y=1.7474A+0.031(R2=0.9997).1.3.3黃酮類化合物檢測取1.3.1待測液1mL,其他步驟如1.3.2,測定510nm處的吸光度,由回歸方程求得黃酮類化合物含量,并按下式計算提取率:黃酮類化合物提取率(%)=[黃酮類化合物質量(g)]/[原料質量(g)]×100%.1.3.4正交試驗及數據處理在單因素試驗基礎上,確定了溶劑提取各影響因素的幾個水平條件;采用L9(34)正交試驗對乙醇濃度、物料比、提取溫度、提取時間四個影響因素進行探討,以提取率為指標,確定最佳提取條件.用DPSv6.55版對試驗結果進行數據處理.1.3.5設計桿菌培養基準確稱取牛肉粉10g、瓊脂糖粉6g混合后加水1000mL在電磁爐上加熱溶解,配制備用.1.3.6馬鈴薯的制備青霉菌、啤酒酵母所使用的培養基配制:將馬鈴薯去皮切成小塊,準確稱取200g,加適量的水在電磁爐上煮沸30min后,過濾得濾液,準確稱取蔗糖20g加適量的水溶解,然后將蔗糖溶液和馬鈴薯溶液混合后加水至1000mL即可.1.3.7培養基的消毒將配好的培養基放入高壓滅菌鍋中121℃滅菌20min.1.3.8發酵菌種的培養在無菌室的超凈工作臺上將供試菌種接至各自的試管斜面培養基中,放入恒溫培養箱進行培養,其中大腸桿菌培養溫度為37℃,培養時間為24h;青霉菌、啤酒酵母菌的培養溫度和時間分別為29℃、48h.1.3.9黃酮類化合物溶液的制備用打孔器將濾紙制成若干直徑為6mm的圓形濾紙片,放入干燥潔凈的培養皿內,經121℃濕熱滅菌20min,浸入黃酮類化合物溶液以及蒸餾水中6h后取出,無菌條件下晾干備用.1.3.1菌種的制備在無菌室的超凈工作臺上,用接種環分別挑取少量活化的菌種放入無菌水中,制成菌體或孢子濃度為106~107CFU/mL的菌懸液,用振蕩器震蕩均勻,備用.1.3.1培養培養基的制備選用直徑為9cm的培養皿,每皿加大約15mL經滅菌處理的培養基,待冷卻凝固后,放置于培養箱中觀察24h,然后將有雜菌生長的培養皿廢棄,在無雜菌生長的培養基中每皿加入供試菌懸液0.5mL,涂布均勻后,用無菌鑷子夾取制備好的濾紙片貼于含菌培養基上,每皿放置2片,各紙片間的距離均等,每一樣品重復3次,倒置培養.同時用浸有無菌水的濾紙片作空白對照.青霉菌和啤酒酵母菌在29℃培養48h,細菌在37℃培養24h,觀察抑菌圈,用游標卡尺量取各個培養皿的抑菌圈直徑,抑菌圈直徑越大,抗菌活性越強.1.3.1黃酮類化物的抑菌性測定把大球蓋菇黃酮類化合物在無菌條件下配成質量濃度為10,20,40g/L的黃酮溶液,按照1.3.11的方法測量不同濃度的抑菌圈直徑,得出不同濃度的黃酮類化物抑菌性的強弱.2結果與分析2.1不同溶劑對大球蓋唑酮類化合物提取率的影響，不同溶劑對大球蓋唑酮類化合物提取率的影響如圖1所示從圖1可以看出,水提取率最低,乙醇的提取率最高,丙酮和乙酸乙脂在中間,且乙醇來源容易、經濟,因此本試驗選乙醇作為溶劑.2.2最佳提取組合的確定表1至表3分別為黃酮類化合物提取工藝的正交試驗設計情況、正交試驗結果和方差分析結果.從表2可知,A(物料比)、B(體積分數)、C(時間)和D(溫度)極差R的大小順序分別是RD>RC>RA>RB,表明溫度對提取率的影響最大,時間次之,物料比的影響位居第三,乙醇的體積分數影響最小.最佳提取組合為A2B3C1D3,即物料比1∶90,乙醇體積分數95%,時間120min,溫度60℃.從表3可看出,提取因素A(物料比)、C(時間)和D(溫度)的F值均達極顯著水平,B(體積分數)的F值達顯著水平,可見各個因素對提取率都有較大的影響.對A2B3C1D3組合進行驗證性試驗,所得的提取率為7.94‰,高于其他組合,表明A2B3C1D3組確實是本試驗條件下大球蓋菇黃酮類化合物的優化提取工藝組合.2.3大黃酮類化合物對不同細菌的抑制作用2.3.1黃酮溶液的抑菌效果表4列出了黃酮溶液對不同菌的抑菌情況,圖2、圖3分別為40g/L黃酮溶液對大腸桿菌和青霉菌的抑菌效果圖.從表4抑菌圈直徑的大小可以看出,40g/L黃酮溶液對這3種菌的抑制作用的大小為大腸桿菌﹥青霉菌﹥啤酒酵母.2.3.2大球蓋菇黃酮類化合物對大腸桿菌、青霉菌和啤酒酵母的抑制作用表5列出了不同質量濃度黃酮溶液對不同菌種的抑菌情況。從表5可知,40,20,10g/L的大球蓋菇黃酮類化合物溶液對大腸桿菌都有抑制作用,且抑制效果差異極顯著.40g/L的大球蓋菇黃酮類化合物溶液對青霉菌也有抑制作用,20g/L和10g/L對青霉菌沒有抑制作用,大球蓋菇黃酮類化合物對啤酒酵母沒有抑制作用.3大球蓋菇黃酮類化合物提取工藝優化通過比較不同溶劑對大球蓋菇黃酮類化合物提取率大小的影響,發現乙醇是大球蓋菇黃酮類化合物所選定幾種樣本溶劑中最好的提取溶劑;在單因素試驗的基礎上,分析濃度、物料比、溫度、時間對大球蓋菇黃