自噬是一種生理機制

自食（自我消化）是通過降低自身的細胞和細胞器官進行一系列生化過程，以實現真核細胞的“自我消化”。在這個過程中,首先是細胞質和細胞器被雙層膜包裹形成自噬泡,然后再與溶酶體融合形成自噬溶酶體,最終使被包裹的細胞質和細胞器降解。自噬主要有3個功能:①自噬是對營養缺乏的一種適應性的反應。當營養缺乏導致細胞內氨基酸減少時誘導自噬的發生,以維持細胞的正常代謝。②自噬參與穩定細胞質內環境的管理。它控制過氧化物酶體、線粒體和內質網的更新。③自噬參與一定的組織特異性融合。自噬既可以作為一種防御機制來抵御環境變化對細胞造成的損傷,同時它作為一種細胞的死亡程序,又可以誘導細胞主動性的死亡。這種雙重機制使其在腫瘤細胞中也產生不同的作用。作為Ⅱ型的程序性細胞死亡——自噬,在某些時候與Ⅰ型程序性細胞死亡——凋亡有著密不可分的聯系,這就使在研究抗腫瘤藥物誘導細胞自噬時也必須考慮這些因素。1腫瘤細胞的自排斥1.1突變前后腫瘤細胞的自噬能力和細胞系統的變化從上世紀70年代末期開始,人們逐漸認識到腫瘤細胞的自噬能力低于同樣部位正常細胞的自噬能力,而且在營養缺乏或者細胞高密度的情況下,腫瘤細胞的自噬能力也不會增加。這就使人們將細胞自噬能力的減少同腫瘤的發生聯系了起來。隨后,在腫瘤的動物模型中也觀察到了這種現象。在對不同腫瘤細胞發展過程的研究中發現,有些腫瘤細胞,如化學致癌物導致的肝癌細胞,在癌變前期的肝結節時就已經出現了自噬能力下降的現象。而鼠的胰腺細胞經致癌物質誘導后,在癌變前期的結節和形成腺瘤的時候自噬和降解能力是增加的,當形成癌細胞時,自噬能力反而減少。這些例子說明大多數腫瘤細胞(如:肝、胰腺、乳腺癌等)盡管癌變前自噬能力各有不同,但是在癌變之后其自噬能力均減弱。自噬能力的衰退可能有利于腫瘤的發展。這提示腫瘤細胞之所以能快速生長,是由于它打破了細胞蛋白質合成速率與自噬體降解蛋白質的平衡。為此,越來越多的研究者從誘導細胞自噬的角度去觀察抗腫瘤藥物作用的分子機制。1.2血清/氨基酸的濃度盡管大多數腫瘤細胞的自噬活性都降低,但是仍然有一些腫瘤細胞保持了較高的自噬活性,如大腸癌、肺癌細胞及人宮頸癌HeLa細胞等。研究表明,在缺乏血清或氨基酸的情況下約3h,HeLa細胞中的自噬部分從4%上升到37%。這些腫瘤細胞所具有的高自噬活性對腫瘤細胞在惡劣環境中的生存起到了一定的保護作用,也可能使一些抗腫瘤藥物的作用減弱。2對藥物過程導致細胞凋亡的機制雖然目前知道一些抗腫瘤藥物可以誘導細胞自噬的產生,但是由于自噬的雙重機制以及自噬和凋亡之間的密切聯系,從而對于某些藥物最終導致細胞死亡的分子機制尚不能肯定。2.1由于自蝕激活，腫瘤細胞死亡2.1.1胞自噬作用如:他莫昔芬(tamoxifen)對乳腺癌MCF-7細胞產生的自噬作用。苦參堿(matrine)可以引起肝癌細胞HepG2形成自噬小體。盼生安(panshengan)對BEL-7402肝癌細胞的作用中也可看到自噬的產生。2.1.2氧化二砷誘導凋亡如:三氧化二砷(As2O3)在低濃度(2μm)時,誘導惡性神經膠質瘤細胞死亡方式是自噬,這一濃度還不會出現骨髓抑制和嚴重的副作用。而三氧化二砷在高濃度時(8～16μm)則是通過誘導凋亡導致細胞死亡。對于APL(急性早幼粒細胞白血病)細胞系,低濃度的三氧化二砷(1μm)就誘導了它們的凋亡。同樣,白藜蘆醇(resveratrol)在低濃度時(50μm),通過誘導卵巢癌細胞的自噬導致細胞死亡,而它殺死前列腺癌細胞的作用主要是通過凋亡途徑。2.1.3誘導腫瘤細胞自噬長春新堿(vincristine)可以誘導肝癌細胞HepG2的自噬性凋亡。這種細胞凋亡有著明顯的自噬特征。據報道,長春堿類抗腫瘤藥可誘導腫瘤細胞自噬的發生,也能誘導腫瘤細胞凋亡。同樣,蘆薈大黃素(aloeemodin)在對鼠的C6神經膠質瘤細胞的作用中,除了可以引起caspase依賴性的凋亡外,還可促進胞質內酸性囊泡的形成,這說明了在蘆薈大黃素的作用下,鼠的C6神經膠質瘤細胞也可以進行自噬性的死亡。2.2誘導細胞增殖自噬作用既可以啟動自噬性的死亡程序抑制腫瘤的發展,同時它也是腫瘤細胞的一種適應性反應,保護腫瘤細胞,防止營養缺乏和藥物帶來的損害。在已知的可以產生自噬作用的抗腫瘤藥物中,大部分藥物在適當濃度(誘導自噬的產生)時就可以抑制腫瘤細胞的增殖,誘導它們死亡。但是有一些藥物在可以誘導細胞產生自噬的濃度時,并沒有引起細胞的死亡。如temozolomide(替莫唑胺),是一種新的烷化劑,用其處理惡性神經膠質瘤細胞U373-MG時發現有自噬產生。使用濃度為100μm的temozolomide,3d后,可以看到U373-MG細胞中有明顯的自噬特征,而且細胞的增殖受到抑制。但作用7d后卻發現細胞開始增殖。這說明了該物質誘導的自噬是可逆的,而且這種自噬可以保護腫瘤細胞,防止其死亡。由于自噬在腫瘤細胞中具有雙重機制,因此,在研究抗腫瘤藥物時,要從正反兩方面去看待腫瘤細胞所產生自噬作用。2.3口皮細胞自噬,所見表4研究發現有些抗腫瘤藥物也能誘導正常細胞的自噬。如5-FU(5-氟脲嘧啶)可以誘導口腔上皮角質化細胞的自噬,通過自噬降解使正常的上皮細胞發生變化,這可能與5-FU這類化療藥會引起機體的不良反應之——粘膜炎有關。3bnip3和lc3在腫瘤形成的過程中,參與細胞自噬調控的多種基因發生異常,從而導致細胞自噬能力的下調。抗腫瘤藥物可以通過調整這些異常的基因提高腫瘤細胞的自噬。如:Beclin-1是酵母Atg6/Vps30的同系物,能和Atg14,Vps34/class3PI3kinase,Vps15共同形成一個多聚體復合物.這個復合物在自噬體的形成過程中起到一個關鍵的作用。Beclin-1作為一種哺乳動物的自噬基因,可以控制細胞的生長,抑制腫瘤的發生。這一作用的產生與它包含有豐富亮氨酸核輸出信號的結構域有關。在40%～75%的彌散性乳腺癌和卵巢癌細胞中,都有Beclin-1的單等位基因缺失。在乳腺癌MCF-7細胞中,增加Beclin-1的表達可以促進自噬,抑制MCF-7細胞的增殖。使用他莫昔芬處理MCF-7細胞后發現,可以增加Beclin-1的表達,這也從分子機制上論證了他莫昔芬可以誘導細胞自噬的產生。作為Bcl-2家族中的一員,BNIP3(Bcl-2/腺病毒E1B19-ku相互作用蛋白3),它擁有Bcl-2同源3功能區,在細胞被誘導發生死亡的過程中,它能夠完全與線粒體的外膜整合,引起線粒體通透性的轉運孔開放,它的高表達可以引起腫瘤細胞發生Ⅱ型細胞程序性死亡——自噬性死亡。因此在三氧化二砷誘導的惡性神經膠質瘤細胞自噬性死亡的過程中,BNIP3發揮著重要的作用。三氧化二砷是通過上調線粒體的細胞死亡蛋白BNIP3,來誘導惡性神經膠質瘤細胞自噬性死亡。LC3(微管相關蛋白1lightchain3),最初是從鼠的大腦中與微管相關蛋白1A和1B一起提純時被發現的,它是酵母Apg8/Aut7p的同系物。在酵母中,Apg8/Aut7p對于自噬體的形成起到了重要的作用。LC3現已作為自噬體的特異性標記蛋白。當哺乳動物的細胞有自噬發生時,LC3-Ⅰ脂質化形成LC3-Ⅱ,定位于自噬體膜,這些定位能夠通過和綠色熒光蛋白或其衍生物結合,形成嵌合蛋白來進行觀測。使用抗腫瘤藥物處理腫瘤細胞時也可以看到這一現象。如用長春堿(vinblastine)處理饑餓的HeLa細胞時,可以看到,LC3的量比不用該藥處理時產生LC3的量明顯增多。在用temozolomide處理惡性神經膠質細胞瘤細胞后,發現LC3-陽性自噬泡數量也明顯增多。這不僅說明了這些抗腫瘤藥物可以激發腫瘤細胞的自噬,同時也指出了這些腫瘤藥物參與了自噬分子的調控。TOR(targetofrapamycin)蛋白屬于磷脂酰激酶相關激酶(PIKKs)家族,它可以調節翻譯的啟動和延長、核糖體的生物合成、氨基酸的轉運、與代謝途徑有關的酶的轉錄和自噬。TOR通過感受細胞內氨基酸和ATP的量來調節自噬,因此又被認為是自噬啟動的門戶。它活化時抑制自噬的發生。雷帕霉素(rapamycin)可以抑制TOR的活性,從而誘導細胞自噬。雷帕霉素是一種抗真菌藥物和免疫抑制劑,同時它還具有抗腫瘤的活性,現在正在對癌癥患者進行Ⅱ期和Ⅲ期的臨床試驗。已經有研究證實雷帕霉素和它的派生物(CCI-779,RAD001andAP23576)在多種惡性腫瘤中可以抑制mTOR(mammaliantargetofrapamycin)的功能,并且產生抑制細胞增殖的作用。至于雷帕霉素是否可以直接誘導腫瘤細胞的自噬,目前還未見相關報道。研究抗腫瘤藥物參與自噬的分子調控,有助于進一步了解自噬與抗腫瘤藥物之間的關系,也為研究抗腫瘤藥物的作用機制開辟了一個更為廣闊的空間。4常見的抗腫瘤藥物近年來,隨著分子生物學的進步和分子藥理的深入探索,為惡性腫瘤的藥物治療提供了不少新靶點,抗腫瘤藥正從傳統的細胞毒藥物向針對多環節作用的新型抗腫瘤藥物發展。其中一些具有新靶點的抗腫瘤藥與自噬也存在著一定的關系。4.1內皮細胞間的相互作用腫瘤內的血管是新生的,腫瘤可通過這些新生的血管實現腫瘤間質的血管化,并在腫瘤的生長和擴散中起重要的作用。近年來腫瘤新生血管生成抑制劑已成為抗腫瘤藥的新靶點。腫瘤內出現血管后,除了血管帶給瘤細胞營養外,內皮細胞本身對瘤細胞也有旁分泌刺激作用。腫瘤新生血管的旁分泌效應源于內皮細胞產生的生長因子和細胞因子,它們刺激腫瘤細胞生長和轉移。Endostatin(內皮抑素)通過抑制內皮細胞增殖,阻止血管生成而發揮抗腫瘤作用。Chau等通過體外實驗證實,用Endostatin誘導EAhy926人內皮細胞的死亡主要是自噬性的死亡。電鏡下觀察Endostatin作用于人內皮細胞6～24h后就可見大量的自噬泡。Endostatin產生的細胞毒作用不依賴于caspase途徑和氧化途徑,但可被3-MA(一種特異的自噬抑制劑)和亮肽素,抑酞酶(絲氨酸,半胱氨酸溶酶體蛋白抑制劑)所調控。4.2產生腫瘤細胞自噬腫瘤分化誘導劑可以誘導某些腫瘤細胞分化為正常或接近于正常的細胞,從而使它們出現類似正常細胞的表型或恢復正常細胞的某此功能。但是這些分化誘導劑也可以引起某些腫瘤細胞發生自噬現象。如:維生素D(VitaminD)和類似物可以誘導處于G1/G2期的白血病細胞向成熟階段分化,阻遏細胞進入S期。同時它們還能抑制乳腺癌細胞和結腸癌的生長。在研究VitaminD的類似物EB1089對乳腺癌MCF-7細胞的作用時發現,它殺死MCF-7細胞時并不依賴于caspase,但是它也能引起染色質凝聚和DNA斷裂。實驗證實,在EB1089的這種啟動核凋亡的作用中包括了依賴Beclin1的自噬途徑。4.3crolxin抑制劑細胞信號在傳導過程中發生障礙或異常就會導致惡性腫瘤增殖、無限生長。細胞信號轉導的靶點包括信號蛋白構象、配基受體結合信號蛋白以及細胞信號轉導過程中的關鍵酶等。表皮生長因子受體(EGFR)屬于酪氨酸激酶受體,它在乳腺癌、卵巢癌、喉癌、食道癌、腦腫瘤等中都有過量表達。響尾蛇毒(crotoxin)為美洲響尾蛇毒液的提取物,Nicholas等使用了不同的鱗狀癌細胞(這些癌細胞表達EGFR水平不同)來觀測crotoxin對它們的抑制作用,發現crotoxin抑制高表達EGFR的細胞生長最有效。從而說明了crotoxin對高表達EGFR的腫瘤細胞有高度的選擇性抑制作用。由于其對多種腫瘤細胞有作用,現在正在對患有實體瘤并且用常規治療難以控制的病人進行Ⅰ期臨床試驗。我們實驗室使用crotoxin處理慢性粒細胞白血病細胞K562和人乳腺癌細胞MCF-7時發現,它在引起這兩種細胞死亡的過程中啟動了自噬。5出現非自噬的藥物自噬是一種生理機制,它在抗腫瘤藥物作用于腫瘤細胞的過程中也會發生。抗腫瘤藥物引起腫瘤細胞發生自噬與藥物的種類、腫瘤細胞的類型、藥物的濃度、藥物作用細胞的時間等因素有關。由于自噬的特點,藥物誘導腫瘤細胞產生自噬后會出現兩種不同的結果:一種是保護細胞防止周圍環境帶來的損害;另一種是啟動細胞主動性的Ⅱ型細胞死亡程序。目前,對于這兩種不同結果的