高效液相色譜法同時測定祛痘類化妝品中12種禁限用物質

抗癲癇藥物或抗癲癇藥物是目前最難控制的藥物類型之一。這種非法添加抗生素的現象很常見。鑒于濫用抗菌類藥物的嚴重后果,我國和歐美發達國家均將抗菌類藥物列入化妝品禁用或限用物質名單。有關高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法測定祛痘類化妝品中抗菌類藥物的方法已有文獻報道[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16],檢測的各類目標成分很多,已發現的非法添加成分主要有甲硝唑、氯霉素、水楊酸、氧氟沙星、環丙沙星等。通過深入研究發現,目前國內祛痘類化妝品非法添加的化學成分主要包括依諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯、氯霉素、氯霉素二醇物、磺胺甲口惡唑、甲硝唑、替硝唑和水楊酸12種。其中,氯霉素、依諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯、磺胺甲口惡唑、甲硝唑、替硝唑等10種成分屬臨床常用抗菌類處方藥,為禁用物質;水楊酸屬消毒防腐類藥物,《化妝品衛生規范》2007年版規定其為限用物質,明確除香波外不得用于三歲以下兒童使用的產品中,同時標簽上必須標注“含水楊酸”,但很多添加水楊酸的祛痘類化妝品未按規定在標簽上標識。如采用現有標準體系檢測上述禁限用物質,至少需要5種以上色譜系統,造成監管資源的巨大浪費。本文建立了一種同時測定化妝品中上述12種化學成分的高效液相色譜方法,可滿足化妝品監督檢驗的實際工作要求,大大提高了監管效能。1實驗部分1.1藥品化學品來源島津LC20-AT型高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器);超純水器;電子天平。依諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯、氯霉素、氯霉素二醇物、磺胺甲口惡唑、甲硝唑、替硝唑、水楊酸均來源于中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純,甲醇、磷酸、三乙胺、鹽酸等其他試劑均為分析純。1.2流動相ab色譜柱:ACEC18(250mm×4.6mm,5μm);流速:1.5mL/min;柱溫:40℃;進樣量:20μL;檢測波長:210nm(林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯)和277nm(氯霉素、氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、依諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口惡唑、水楊酸);流動相:乙腈(A),0.025mol/L磷酸三乙胺溶液(B,取1.54mL磷酸至930mL水中,用三乙胺調至pH5.5,加入70mL乙腈,混勻),梯度洗脫:0～10min,100%～95%B;10～15min,95%～93%B;15～22min,93%～62%B;22～23min,62%～100%B;23～32min,保持100%B。1.3混合標準溶液的配制分別準確稱取12種標準品適量,用甲醇-0.1mol/L鹽酸混合溶液(體積比1∶1)配制成質量濃度約為2500mg/L的標準儲備溶液。分別精密量取一定體積的氯霉素、氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、依諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口惡唑、水楊酸標準儲備溶液,用流動相B稀釋配制成5、10、20、40、100、200mg/L的系列混合標準溶液Ⅰ。分別精密量取一定體積的林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯標準儲備溶液,用流動相B稀釋配制成25、50、100、200、500、1000mg/L的系列混合標準溶液Ⅱ。1.4分析用量準確稱取樣品約1.0g,置10mL具塞比色管中,加甲醇與0.1mol/L鹽酸混合溶液(體積比1∶1)至刻度,搖勻,超聲提取20min,必要時離心,取上清液經0.45μm濾膜過濾后供分析用。若樣品中待測成分的濃度超出線性范圍的上限,用流動相B為稀釋溶劑進行適當稀釋處理。1.5定性分析的方式采用與標準品色譜保留時間和紫外吸收光譜圖比較的方式進行定性分析;取系列標準溶液Ⅰ和Ⅱ分別進樣,以質量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,進行線性回歸建立標準曲線,用外標法進行定量分析。2結果與討論2.1實驗條件的優化2.1.1堿土中酸液或堿液從溶解度上分析,氯霉素、氯霉素二醇物、水楊酸微溶于水,易溶于甲醇、乙醇;硝基咪唑類微溶于水和乙醇;喹諾酮類藥物微溶于水和甲醇,易溶于酸溶液或堿溶液;林可霉素類藥物易溶于水或甲醇中;磺胺甲口惡唑在水中幾乎不溶,在稀酸溶液中易溶。用水溶液作為提取溶劑時,氯霉素、氯霉素二醇物、磺胺類等成分的回收率較低;用純甲醇或乙腈作為提取溶劑時,喹諾酮類成分的回收率較低;比較發現,甲醇-0.1mol/L鹽酸(體積比1∶1)作為提取溶劑時,12種成分的提取效率高,回收率穩定。2.1.2紫外吸收特征從12種禁限用物質的紫外光譜圖來看,氯霉素、氯霉素二醇物的紫外吸收光譜相似,最大吸收波長在271～277nm左右;依諾沙星、環丙沙星和氧氟沙星的吸收光譜相似,最大波長在265～295nm;甲硝唑和替硝唑的最大吸收波長均為319nm;磺胺甲口惡唑和水楊酸的最大吸收波長分別為266nm和296nm;林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯無紫外吸收特征,存在末端吸收。綜合考慮后選取277nm作為氯霉素、氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、依諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口惡唑和水楊酸的檢測波長,選擇210nm作為林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯的檢測波長。2.1.3流動相ph值的影響12種成分中既有酸性化合物和堿性化合物,又有兩性化合物,因此流動相pH值對分離效果的影響較大?？疾炝肆鲃酉鄍H值為4.0～6.0時的色譜行為,隨著pH值增加,氯霉素二醇物、氧氟沙星、林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯的保留時間明顯增加,依諾沙星、環丙沙星和磺胺甲口惡唑的保留時間明顯減少,甲硝唑、替硝唑、水楊酸和氯霉素的保留時間變化不大。在pH5.5時,各成分的分離效果最好。2.1.4溫度對林分測定總樣的影響分別考察了30、35、40、45℃柱溫條件下12種成分的色譜行為。實驗結果表明,溫度升高時,林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯的保留時間增加,其他成分的保留時間減少。在40℃時各成分的分離效果最優。2.2標準品的相對標準偏差分別吸取100mg/L和500mg/L的對照品溶液20μL,在波長277nm和210nm分別平行測定6次,氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、水楊酸、氯霉素、依諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口惡唑(100mg/L)峰面積的相對標準偏差分別為0.6%、0.04%、0.1%、0.6%、0.03%、0.03%、0.5%、0.04%和0.6%,林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯(500mg/L)峰面積的相對標準偏差分別為0.2%、0.1%和0.5%。分別吸取100mg/L和500mg/L的標準品溶液20μL,于0、2、4、8、12、24h時進樣,氯霉素二醇物、甲硝唑、替硝唑、水楊酸、氯霉素、依諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星、磺胺甲口惡唑(100mg/L)峰面積的相對標準偏差分別為0.6%、0.1%、0.3%、1.9%、0.2%、0.2%、0.5%、0.2%和0.5%,林可霉素、克林霉素和克林霉素磷酸酯(500mg/L)的相對標準偏差分別為0.2%、0.5%和1.7%。表明樣品溶液在24h內穩定。2.3克林素、克林氧化酶、克林氧化酶磷酸酯2種成分的線性關系取“1.3”配制的系列混合標準溶液,按上述方法測定,線性范圍、回歸方程及相關系數見表1。林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯3種成分在25～1000mg/L范圍內線性關系良好,其他9種成分在5～200mg/L范圍內線性關系良好,相關系數均大于0.997。在霜劑空白樣品中加入一定量的對照品溶液,按S/N=3和S/N=10分別計算儀器檢出限和定量下限,方法的檢出限和定量下限結果見表1。2.4測定樣品的測定取一批霜劑空白樣品各1g,分別做高、低兩個濃度水平的加標回收實驗,平行配制6份,按上述方法進行測定,結果見表2。12種禁限用物質的平均回收率為88%～115%,RSD均小于5%,符合國家食品藥品監督管理局發布的《化妝品及其原料中禁限用物質檢測方法驗證技術規范》要求。2.5非法添加化學成分在優化條件下,標準品溶液的色譜圖見圖1,12種成分的色譜峰分離度均大于2.2,理論塔板數均大于6650。按上述方法,從商場收集133批化妝品,檢出成分為甲硝唑、氯霉素、氯霉素二醇物、磺胺甲口惡唑、林可霉素、氧氟沙星、依諾沙星、替硝唑,合格率為91.7%;從網絡收集228批化妝品,12種成分均有檢出,合格率僅為58.7%。在檢出的12種非法添加化學成分中,依諾沙星、克林霉素磷酸酯、氯霉素二醇物、替硝唑等為國內首次報道。在不合格樣品中,最常見劑型為膏霜劑,檢出頻率最高的成分為林可霉素、氧氟沙星和甲硝唑;混合添加占非法添加樣品的65.1%,最常見添加方式為“硝基咪唑類+林可霉素類+喹諾酮類”。同時混合添加各種藥物引發的不良反應值得關注。研究還發現大部分含有氯霉素的化妝品均同時檢出含量較高的氯霉素二醇物,甚至發現只含氯霉素二醇物不含氯霉素的情況。氯霉素二醇物是合成氯霉素的主要中間體或手