第五章微生物的生長規(guī)律及控制微生物的特點：個體微小肉眼看到或接觸到的微生物是成千上萬個單個的微生物組成的群體。微生物接種是群體接種，接種后的生長是微生物群體繁殖生長。對細菌群體生長規(guī)律的了解是對其進行研究與利用的基礎一、微生物的個體生長和同步生長

1.

微生物個體細胞的生長（1）細菌的生長一個新生的細胞長大到最后分裂為兩個子細胞的過程稱為細胞周期。在細胞周期內主要的細胞學變化是細胞的表面生長即細胞壁的增生、DNA的復制以及細胞分裂成子代細胞。細菌培養(yǎng)物在培養(yǎng)條件下度過的時間稱為細菌的菌齡。（2）酵母菌的生長酵母菌主要的繁殖方式是出芽，酵母菌細胞的生長——芽細胞的生長。酵母菌的細胞周期是兩次細胞分裂之間的時間，這個周期分為四個時期：間隔期G1、DNA合成期S、第二間隔期G2、有絲分裂期M.（3）霉菌的生長絲狀真菌的生長時從孢子萌發(fā)開始的，以其菌絲頂端延長的方式進行的。當菌絲伸長到一定程度后就會出現(xiàn)分枝。2.微生物的同步生長目前使用的方法：（1）電子顯微鏡觀察細胞的超薄切片設法使某一群體中的所有個體細胞盡可能都處于同樣細胞生長和分裂周期中，通過分析此群體在各階段的生物化學特性變化，來間接了解單個細胞的相應變化規(guī)律。（2）同步培養(yǎng)（synchronousculture）技術這種通過同步培養(yǎng)的手段而使細胞群體中各個體處于分裂步調一致的生長狀態(tài)，稱為同步生長（synchronousgrowth）。獲得微生物同步生長的方法：（1）環(huán)境條件誘導法氯霉素抑制細菌蛋白質合成；細菌芽孢誘導發(fā)芽；藻類細胞的光照、黑暗控制；用EDTA或離子載體處理酵母菌；短期熱休克（40℃）法等。（2）機械篩選法利用處于同一生長階段細胞的體積、大小的相同性，用過濾法、區(qū)帶密度梯度離心法或膜洗脫法收集同步生長的細胞。有效和常用的方法

——Helmstetter-Cummings技術由于細胞的個體差異，同步生長往往只能維持2-3個世代，隨后又逐漸轉變?yōu)殡S機生長。二、單細胞微生物的典型生長曲線生長曲線（GrowthCurve）：

定量描述液體培養(yǎng)基中微生物群體生長規(guī)律的實驗曲線，稱為生長曲線（growthcurve）。在微生物學中提到的“生長”，均指群體生長。細菌接種到定量的液體培養(yǎng)基中，定時取樣測定細胞數(shù)量。以培養(yǎng)時間為橫座標以菌數(shù)為縱座標作圖得到的一條反映細菌在整個培養(yǎng)期間菌數(shù)變化規(guī)律的曲線！細菌的生長曲線一般用菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標作圖根據(jù)微生物的生長速率常數(shù)（growthrateconstant），即每小時的分裂次數(shù)（R）的不同，一般可把典型生長曲線粗分為延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期等4個時期。延滯期指數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期延滯期指數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期對于絲狀生長的真菌和放線菌來說，是一條“非典型”的生長曲線，真菌的生長曲線大致可分3個時期，即生長延滯期、

快速生長期、生長衰退期。又稱停滯期、調整期和適應期。指少量單細胞微生物接種到新鮮培養(yǎng)基后，在開始培養(yǎng)的一段時間內細胞數(shù)目不立即增加，或增加很少，生長速度接近于零的一段時期——代謝系統(tǒng)是正在適應新環(huán)境。（一）延滯期（Lagphase）延滯期分裂遲緩、代謝活躍①

生長速率常數(shù)為零；②

細胞形態(tài)變大或增長，許多桿菌可長成絲狀，Eg.巨大芽孢桿菌（Bacillusmegaterium）在延滯期末，細胞的平均長度比剛接種時長6倍；一般來說處于遲緩期的細菌細胞體積最大！1.延滯期的特點細胞處于活躍生長中，只是分裂遲緩。在此階段后期，少數(shù)細胞開始分裂，曲線略有上升。③細胞內RNA尤其是rRNA含量增高，原生質呈嗜堿性；④合成代謝十分活躍，核糖體、酶類和ATP合成加速，易產生各種誘導酶；⑤對外界不良條件如NaCI溶液濃度、溫度和抗生素等理化因素反應敏感。

微生物接種到一個新的環(huán)境，暫時缺乏分解和催化有關底物的酶，或是缺乏充足的中間代謝產物等。為產生誘導酶或合成中間代謝產物，就需要一段適應期。調整代謝2.遲緩期出現(xiàn)的原因（1）菌種的遺傳性影響延滯期長短的因素很多（2）接種齡指接種物或種子（inoculum，復數(shù)inocula）的生長年齡，亦即它處在生長曲線上哪一個階段時用來作種子的。這里指某一群體的生理年齡。種子的接種齡子代培養(yǎng)物的延滯期對數(shù)期短穩(wěn)定期居中延滯期或衰亡期長（3）接種量

接種量的大小明顯影響延滯期的長短。接種量小延滯期長接種量大延滯期短在發(fā)酵工業(yè)上，為縮短延滯期以縮短生產周期，提高發(fā)酵效率，一般采用較大的接種量。種子：發(fā)酵培養(yǎng)基＝1：10，V/V（4）培養(yǎng)基成分天然培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富延滯期短組合培養(yǎng)基營養(yǎng)單調延滯期長發(fā)酵生產中發(fā)酵培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基成分盡量接近（1）通過遺傳學方法改變種的遺傳特性使延滯期縮短；（2）利用對數(shù)生長期的細胞作為種子；（3）盡量使接種前后所使用的培養(yǎng)基組成不要相差太大；（4）適當擴大接種量；3.生產實踐中縮短延滯期的常用手段（二）對數(shù)生長期（Logarithmicphase

）又稱指數(shù)生長期（Exponentialphase）。指在生長曲線中，緊接著延滯期的一段細胞數(shù)以幾何級數(shù)增長的時期。指數(shù)期1.對數(shù)生長期的特點①生長速率常數(shù)R最大，因而細胞每分裂一次所需的時間——代時（generationtime，G，又稱世代時間或增代時間）或原生質增加一倍所需的倍增時間（doublingtime）最短；②細胞進行平衡生長（balancedgrowth），菌體各部分的成分十分均勻；③酶系活躍，代謝旺盛；

對數(shù)生長期的細菌個體形態(tài)、化學組成和生理特性等均較一致，代謝旺盛、生長迅速、代時穩(wěn)定，所以是研究微生物基本代謝及遺傳特性的良好材料。它也常在生產上用作種子，使微生物發(fā)酵的遲緩期縮短，提高經(jīng)濟效益。2.對數(shù)生長期的3個重要參數(shù)（1）繁殖代數(shù)（n）x2=x1·2n

lgx2–lgx1n=————————=3.322（lgx2–lgx1）

lg2（2）生長速率常數(shù)（R）n3.322（lgx2–lgx1）R=————————=————————————————

t2–t1t2–t1

（3）代時（G）1t2–t1G=————=————————————————R3.322（lgx2–lgx1）

在細菌個體生長里，每個細菌分裂繁殖一代所需的時間為代時（Generationtime）；在群體生長里細菌數(shù)量增加一倍所需的時間稱為倍增時間（Doublingtime）。影響微生物增代時間（代時）的因素①菌種，不同的微生物及微生物的不同菌株代時不同；②營養(yǎng)成分，在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長代時短，反之則長；③營養(yǎng)物濃度，營養(yǎng)物的濃度可影響微生物的生長速率和生長總量，在一定范圍內，生長速率與營養(yǎng)物濃度呈正比；凡是處于較低濃度范圍內，可影響生長速率的營養(yǎng)物成分，就稱為生長限制因子（growyh-limitedfactor）。④培養(yǎng)溫度，在一定范圍，生長速率與培養(yǎng)溫度呈正相關。（三）穩(wěn)定期（stationaryphase）又稱恒定期或最高生長期。其特點是生長速率常數(shù)R等于0，即處于新繁殖的細胞數(shù)與衰亡的細胞數(shù)相等，或正生長與負生長相等的動態(tài)平衡之中。穩(wěn)定期這時的菌體產量達到了最高點，而且菌體產量與營養(yǎng)物質的消耗間呈現(xiàn)出一定的比例關系，這一關系就是生長產量常數(shù)Y（或稱生長得率，growthyield）。

x–x0

x–x0Y=——————=——————C0–CC0

x——穩(wěn)定期時的細胞干重（g／ml培養(yǎng)液），x0——剛接種時的細胞干重，C0——限制性營養(yǎng)物的最初濃度（g／ml），C——穩(wěn)定期時限制性營養(yǎng)物的濃度（由于計算Y時必須用限制性營養(yǎng)物，所以C應等于0）。進入穩(wěn)定期，細胞重要的分化調節(jié)階段，細胞內開始積聚糖原、異染顆粒和脂肪等內含物；芽孢桿菌一般在這時開始形成芽孢或建立自然感受態(tài)等；有的微生物在穩(wěn)定期時還開始合成抗生素等次生代謝產物（secondarymetabolites）——穩(wěn)定期產物（idiolites）。以指數(shù)期為主的菌體生長期（trophophase）以穩(wěn)定期為主的代謝產物合成期（idiophase）生長期穩(wěn)定期到來的原因①營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡；②營養(yǎng)物的比例失調，例如C／N比值不合適等；③酸、醇、毒素或H2O2等有害代謝產物的累積；④

pH、氧化還原勢等理化條件越來越不適宜等。以生產菌體或與菌體生長相平行的代謝產物（SCP、乳酸等）為目的的某些發(fā)酵生產來說，穩(wěn)定期是產物的最佳收獲期；對生產實踐的指導意義對維生素、堿基、氨基酸等物質進行生物測定（bioassay）來說，穩(wěn)定期是最佳測定時期；通過對穩(wěn)定期到來原因的研究，還促進了連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和工藝、技術的創(chuàng)建。可延長穩(wěn)定生長期，以獲得更多的菌體物質或積累更多的代謝產物。生產上的措施補充營養(yǎng)物質（補料）取走代謝產物調節(jié)pH調節(jié)溫度對好氧菌增加通氣、攪拌或振蕩（四）衰亡期（declinephase或deathphase）在衰亡期中，個體死亡的速度超過新生的速度，整個群體呈現(xiàn)負生長狀態(tài)（R為負值）。衰亡期細胞形態(tài)發(fā)生多形化，例如會發(fā)生膨大或不規(guī)則的退化形態(tài)；有的微生物因蛋白水解酶活力的增強而發(fā)生自溶（autolysis）；有的微生物在這一期合成或釋放對人類有益的抗生素等次生代謝產物；在芽孢桿菌中，芽孢釋放等。產生衰亡期的原因外界環(huán)境對繼續(xù)生長越來越不利，Eg.營養(yǎng)物質耗盡和有毒代謝產物的大量積累等，從而引起細胞內的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導致菌體死亡。該時期死亡的細菌以對數(shù)方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分細菌產生抗性也會使細菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。不同的微生物或同一種微生物對不同物質的利用能力是不同的。有的物質可直接被利用（Eg.葡萄糖或NH4+等）——稱為速效碳源（或氮源）；有的需要經(jīng)過一定的適應期后才能獲得利用能力（Eg.乳糖或